Hematološki učinci nove aktivnosti mutantnog p53 u staničnog ciklusa, apoptoze i osjetljivost na citostatike

Povrede funkciju p53 su najsvestraniji u različitim tumorima molekulyarnymizmeneniem osoba. Oni mogu voznikatlibo ni u normalnim stanicama i na taj način povećava veroyatnostobrazovaniya neoplastičnih klon njega, ili se uzhev tumorske stanice i odrediti daljnji napredak novoobrazovaniya.Sleduet naglasiti da promjenom regulacije kletochnogotsikla kontrolne točke i apoptozu, P53 disfunkcija mijenjati chuvstvitelnostkletok na citostatike.

U pravilu, u tumorima otkrila missens-mutaciju p53, privodyaschiek jedna aminokiselina zamijenjena s drugom i s najvećim chastotoymutatsii nalazi u tri "hot spots": Kodonah175, 248 i 273. Vjerojatno ekspresija mutantnog p53 veže kletkedopolnitelnye selektivna prednost nad stanicama u kojima se mijenja u vodi p53 gena na gubitak ekspressiipovrezhdennogo alela. Ova činjenica može se objasniti krayneymere dva razloga. Prvo, mutirani protein ima dominantnu negativnymeffektom protiv divljeg tipa proteina, tj mutatsiyadazhe točku u jednom od dva alela može potpuno potisnuti ohrannuyufunktsiyu p53. Drugo, u posljednjih nekoliko godina postoje podaci koji ukazuju na postojanje mutiranih oblika p53 novostečene aktivnosti ("dobitak-of-funkcije"). Poznato je, na primjer, da je za schettakih aktivnosti mutantnog p53 može specifično i vysokoyaffinnostyu vezanja MAR / SAR DNA-elementa, što uzrokuje remodelirovaniehromatina, trans-aktiviranje promotora nekoliko gena (onkogen myc, receptor epidermalnog faktora rasta i drugi.) I uvelichivatmetastatichesky potencijal tumorske stanice. Međutim molekulyarnyeosnovy novostečene aktivnosti i njihova uloga praktički nije ispitivan u kantserogenezapoka procesa.

Pokušali smo ispitati utjecaj novo priobretennyhaktivnostey mutanta p53 o regulaciji staničnog ciklusa, apoptozai osjetljivost na citostatike. Da biste to učinili, bili smo proučavali effektymutantnyh zamjene p53 aminokiselina u kodona 175, 248 ili273 se "hot spots" razlichnyhopuholyah mutacije u ljudi. Novi mutantni p53 aktivnost je otkrivena od prijenosa u kulturi stanica in vitro bez produtsiruyuschieendogenny p53. Korištenje stanicama bez p53 ekspressiyaendogennogo, što je moguće kako bi se uklonili postojanje dominantne-negativnogoeffekta i istražiti učinak novostečenom samo aktivnosteytransdutsirovannogo mutantu p53.

Dobili smo i derivati ​​ljudskih stanica analizirana myshii konstitutivnu ili tetraciklina represivna ekspressieyekzogennogo p53. U tom slučaju, ekspresijom mutantnog r53podavlyalas dodavanje tetraciklin u medij za kulturu (1mkg / ml). 24-48 sati nakon prijenosa kontakt subliniykletok dobivenog u mediju bez indukcije tetraciklin uočeno ekspressiiekzogennogo mutant p53 ne prati povećanje ekspressiigenov ciljni p53 divljeg tipa (p21WAF1 et al.).

Utjecaj novih aktivnosti mutanta p53 u stanični ciklus stopa stanične proliferacije

Novo stečena mutant p53 aktivnost uzrokuje suschestvennoeuvelichenie stopu stanične proliferacije. Tako, uvođenje vektora konstitutivno eksprimira mutantni p53-His175, povyshaetskorost reprodukcije p53-negativne mišje fibroblaste linii10 (3) je oko 1,5 :. smanjena od 23,5 sati do 16 sati, u logaritamskoj fazi rasta stanica je populacija promatrana vremyaudvoeniya Shodnayakartina u slučaju tetraciklina reguliran ekspressiir53-His175 u pluća humanog karcinom linija mišjeg N1299ili fibroblasta liniju 10 (1), što je potvrdilo svyazvyyavlennyh razlike u brzini proliferacije ekspressieymutantnogo točno s p53, a ne bilo sekundarne promjene voznikayuschimiv rezultat kontinuiranog odabiru s egzogenim mutantnymr53 stanicama. Treba naglasiti da je indukcija ekspresije p53 divljeg tipa staničnih konteksta ne do smanjenja već uvelicheniyuvremeni udvostručenja populacije stanica ili apoptoza.

Ubrzanje staničnu proliferaciju pod utjecajem novo priobretennyhaktivnostey mutanta p53 zbog, navodno, njihova vozdeystviemna regulacija staničnog ciklusa. Analizirajući kinetiku pojavnosti mechenyhmitozov nakon toga 5-bromodeoksiuridina za 20 min., Mi opredelyaliprodolzhitelnost pojedine faze staničnog ciklusa rasta logarifmicheskoyfaze. Pronađeno je da uključivanje ekspresije mutanta r53znachitelno smanjuje vrijeme za staničnog ciklusa trajanje skraćenje schetsuschestvennogo S faze. Tako mutantnyyr53 nema značajan učinak na trajanje drugihfaz staničnog ciklusa.

Novo stečenim mutantni p53 aktivnost, osim izmeneniyregulyatsii staničnog ciklusa u normalnim fiziološkim uvjetima, može modificirati G1-kontrolne točke funkcija aktivira s povrezhdayuschimivozdeystviyami. Otkrili smo da je indukcija ekspresije mutantnogor53-His175 stanica 10 (1), a H1299 dovodi do činjenice da je S-fazuvhodit 1,5-2 puta više stanica sa DNA oštećenja, indutsirovannymialkiliruyuschim spoj etil metansulfonat (EMS), a zatim p53 divljeg kakekspressiya vrsta, naprotiv, smanjuje udio povrezhdennyhkletok uključen u s-fazu. U isto vrijeme, p53-His175 prakticheskine utječe na aktivnost kontrolne točke koje rade u G2.

Mehanizmi smo identificirali učinke novostečene aktivnosteymutantnogo p53 u regulaciji staničnog ciklusa do neyasny.Naibolee vjerojatna pretpostavka da su to izmeneniyasvyazany s mogućnošću p53-His175 povećavaju ekspresiju genamyc. Njegov proizvod, kao što je prethodno prikazano, može, s jedne strane, trans-aktivirati gen ornitin dekarboksilaze i poziv, Tako bolesti, skraćivanje S-fazu, i s druge strane aktiviraju kompleksytsiklin E / CDK2 i otkazivanje zaustavljena oštećenih stanica u perehodeiz G1 u S ,

Utjecaj novih aktivnosti mutanta p53 u indukciji apoptoze

Mutant p53 može izmijeniti učinak citostatika, samo izmenyayane propis G1-kontrolne točke, ali i slabljenje indukciju apoptoza.Pri ova nova djelatnost mutanta p53 djelovati kao naapoptoz uzrokovana oštećenja DNA i apoptozu izazvanu"smrt domena" ("receptori smrti") U kulturi srednje posledobavleniya TNF-a ili anti-Fas. Sleduetpodcherknut da takvi efekti mutantnog p53 u velikom stepenizavisyat na specifične supstitucije amino kiselina, kao što su apoptoze i eventualno staničnom kontekstu. Tako, p53-His175, mnogo jače od p53-Trp248 ili p53-His273, inhibira apoptozu induciranu DNA povrezhdayuschimivozdeystviyami (EMC etopozid). U isto vrijeme, p53-His273 jači od p53-His175, potiskuje Fas-inducirana apoptoza u prostate rak chelovecheskihkletkah linije PC-3. Osim toga, razni mutantnyer53 različito utjecati na apoptozu potaknutu Fasi TNF-a.

Mehanizmi djelovanja novostečene aktivnosti u regulaciji apoptoze mutantnyhr53 studirao do prilično loše. Nedavnoobnaruzheno da je jedan od takvih regulacije može yavlyatsyatrans BAG1 aktivacije gena koji kodira antiapoptotski beloksemeystva bcl-2.

Utjecaj novih aktivnosti mutanta p53 u kemoterapijskih lijekova chuvstvitelnostk

Osim nespecifičnih učinaka na osjetljivost na tsitostatikamposredstvom promjene u regulaciji staničnog ciklusa i apoptoze, novyeaktivnosti mutant p53 može imati više spetsificheskoedeystvie osjetljivost na određene lijekove sredstvamputem promjene u regulaciji kemoterapija cilja. Pomoću hibridizacije metodsubtraktivnoy smo identificirali nepoznatu raneemisheni transaktivaciju mutantnog p53 djelovanja i pronašli da skupina gena aktivirana posebno mutirani gen p53 uključuje kodira deoksi-UTP-ASE. Funkcija dUTFazy zaklyuchaetsyav hidroliza dUTP na deponij i pirofosfat. S druge strane, da se formira deponij sluzhitsubstratom dTTP de novo. Pretpostavlja se da povyshenieurovnya dUTFazy može uzrokovati otpornost na 5-fluoruracil, shirokoprimenyaemomu kemoterapeutika čiji mehanizam djelovanja inhibicijom sinteze svyazans dTTP timidilatsintetazy.My suzbijanju aktivnost je pokazala da je indukcija p53-His175 ili p53-His248, kao i uvođenje konstrukt eksprimiraju UTP -azu, čak i u svim ispitivanim kultura (pluća H1299 karcinoma rakyaichnika SKOV-3, fibroblasta 10 (1), do 1,5-2 puta povećana chislokletok mogle su stvarati kolonije nakon izlaganja 5-fluorouracila a.Pri ova otpornost na dva različita lijeka - metotreksatui su adriamicin - nije povećala u isto vrijeme p53-His273, neobladayuschy sposobnost da trans-aktivirati UTP-ase gena ne uvelichivalustoychivost podatke iz stanične kulture s 5-fluorouracilom ..

Očito, postoje i drugi načini na koje mutant p53 aktivnost vnovpriobretennye utjecaj chuvstvitelnostkletok određenim citostaticima. Tako smo pronašli da vleykoznyh K562 stanice, za razliku od stanica 10 (1), i sur., Expression of p53-His175 uzrokuje značajno smanjenje chuvstvitelnostik metotreksata. Izražavanje ovog mutanta nekoliko uvelichivalatakzhe otpornosti stanica leukemije u vinblastin akcija noprakticheski nije promijenio osjetljivost na etopozid. Istovremeno, izraz p53-His273 nije spustio, nego naprotiv, nekoliko povyshalachuvstvitelnost K562 stanica na metotreksat i vinblastin. Mehanizmyetih učinci ostaju nejasni.

Dakle, utvrdili smo da je nedavno stekla aktivnostimutantnyh p53 supstitucije aminokiselina na različitim položajima razlichnymobrazom utjecati na osjetljivost na različite kemoterapijskih lijekova. Prietom može se razlikovati ne samo učinaka raznih mutiranih p53 vode i tip isti stanica, ali i djelovanje istih mutantav stanica različitog porijekla. Sve je to potrebno uchityvatpri tijeku pokušaji ispolzovatmutatsii P53 predvidjeti rezultate kemoterapiju kancera.