Osnove molekularnu terapija. genska terapija

Video: Molekularna osnova individualizaciji terapije sa čestim mutacijama u NSCLC

sadržaj

Video: molekularna osnova individualizaciji terapije sa čestim mutacijama u nsclc
Genska terapija

Utvrđivanje položaja i slijed gena čije mutacije uzrokuju određene bolesti, kao i najmodernije metode mutacije i njegovog testiranja može dijagnosticirati bolesti u neo, pa čak i prenatalnog razvoja organizma. To omogućuje da se ublaži očitovanje genetskog defekta od liječenja, prehrane, transfuzije krvi, itd

Međutim, ovaj pristup ne dovodi do korekcije defekta i općenito, nasljedna bolest se ne može izliječiti. Situacija se komplicira činjenica da je mutacija jednog gena može proizvesti različite učinke na tijelo. Ako je mutacija uzrokuje promjene u enzimske aktivnosti za koje kodove, to može dovesti do nakupljanja toksičnog supstrata ili, alternativno, na nedostatak spoja neophodne za normalno funkcioniranje stanica.

Dobro poznati primjer takvih bolesti fenilketonuriju. Da je uzrokovana mutacijom u genu za enzim jetre fenilalanindegidroksilazy katalizirati konverziju fenilalanina natrag u tirozin. Rezultat je povećana razina endogenog fenilalanina u krvi, što uzrokuje nepravilno stvaranje mijelinske ovojnice oko aksone živčanih stanica središnjeg živčanog sustava, a kao rezultat, teške mentalne retardacije.

Ako je mutacija utječe na strukturne gene proteina, onda to može dovesti do ozbiljnih poremećaja na razini stanica, tkiva ili organa. Primjer takve bolesti je cistična fibroza.

Brisanje u genu koji kodira protein zvan cistične fibroze transporter dovodi do sinteze proteina (neispravnog nedostatak fenilalanina 508) i poremećaja transporta kloridnih iona kroz stanične membrane. Jedan od najvažnijih štetnih posljedica toga je da sluzi koje linije i štiti pluća, postaje nenormalno debeo. To otežava pristup stanicama pluća i doprinosi akumulaciji štetnih mikroorganizama. Stanica sluznice dišnih puteva pluća, su ubijeni i zamijeniti vlaknastim tkivom ožiljka (otuda ime bolesti). Kao rezultat toga, pacijent umire od zatajenja srca.

Nasljedne bolesti se razlikuju složene klinički simptomi i njihova obrada je uglavnom traditsinnoe simptomatičan: za tretiranje fenilketonurija bezalaninovuyu propisane prehrane, zamijeniti s greškom funkcionalne proteine intravenskom primjenom, nadomjestiti izgubljene funkcije koje obavljaju koštane srži ili presađivanja drugih organa. Sve ove mjere su uglavnom neučinkoviti, skupo, izdržljiv, i nekoliko pacijenata preživjeti do starosti. Dakle, razvoj novih terapija je vrlo hitno.

genska terapija

Genska terapija se zove genetski inženjering ljudskih somatskih stanica, s ciljem ispravljanja genetski defekt koji uzrokuje bolest. Korekcija specifičnih bolesti se provodi dovođenjem u stanica defektnih normalnih somatskih izraženim genima. Za na 80 godina. Kada su stvorili razvijene metode za pripremu pojedinih gena i eukariotske vektore ekspresije, postaje rutinske eksperimente prijenos gena kod miševa genetski korekciju perspektive postati stvaran.

U 1990. godini u SAD-u od Dr. W. francuskog Anderson (W. Francuski Andrson) prvi pokušaj na gensku terapiju za liječenje teške kombinirane imunodeficijencije (SCID) u djevojku tri godine Ashanti de Silva (Ashanthi da Silva) došlo je. Ova bolest uzrokovana mutacijom u genu koji kodira adenozanadenilazu (ADA). Nedostatak tog enzima omogućuje gomilanje adenozina i deoksiadenozin krvi, od kojih toksično djelovanje dovodi do smrti B i T-limfocita u perifernoj krvi i, kao posljedica imunodeficijencije.

Djeca s ovom bolešću treba biti zaštićen od bilo kakvih infekcija (sadržane u posebnim sterilnim komorama), kao i bilo koje bolesti može biti kobno. 4 godine nakon početka liječenja dijete je primijetio izraz normalno funkcioniranje ADA SCID i olakšanje simptoma, što je omogućilo joj je da napusti sterilnu komoru i živjeti normalan život.

Dakle, to je pokazao u principu mogućnost uspješnog genske terapije somatskih stanica. Od 90-ih godina. testiran broj genske terapije genetskih bolesti, među kojima su najteže, kao hemofilija, AIDS, različitih tipova malignih neoplazmi, cistične fibroze i ostalih. Trenutno se mogu liječiti kroz transgeneza oko 10 ljudskih bolesti.

Razne genetskih bolesti prethodno određena više razvoja pristupa genske terapije. Tako riješiti dva glavna problema: sredstvo za isporuku terapijski gena- metoda za pružanje ciljano u stanice namijenjene za ispravljanje. Do sada su svi pristupi genskoj terapiji somatskim stanicama se mogu podijeliti u dvije kategorije: (Sl. 3.15) ex vivo terapije i in vivo.

Sl. 3.15. Shema ex vivo genske terapije (a) i in vivo (a)

ex vivo genska terapija uključuje ispravljanje genetski defekt stanica izvan tijela, a zatim se vraćaju u normalno funkcioniranje stanica u tijelu.

in vivo genske terapije uključuje isporuku terapeutskog gena izravno u stanice određenog tkiva pacijenta. Razmislite o ovim pristupima u više detalja.

ex vivo genske terapije uključuje sljedeće korake:
1), čime deficijentne stanice pacijenta, te ih uzgoj;
2) prenošenje željeni gen u izolirane stanice transfekcijom terapeutskog gena konstruktom;
3) izbor i kapacitet genetski korigirani stanica;
4) ili transplantacije transfuzija ovih stanica u pacijenta.

Korištenje pacijenta vlastite stanice osigurava da po povratku on nije razvio imunološki odgovor. Prijenos gena konstrukta postupak treba biti učinkovita, ali normalno gena treba održavati stabilno i kontinuirano izražena.

Sredstva za transfer gena stvorio po prirodi, su virusi. Da bi se dobio učinkovitih vektora genske dostave za dvije grupe virusa se koriste uglavnom - (. Vidi sliku 3.16) adenovirusi i retrovirusi. genetski detoksificiran varijanti virusa upotrebljavaju u genskoj terapiji.

Sl. 3.16. Virusi koji se koriste za izradu terapeutskog vektora

Razmislite uređaja i korištenje dizajna temelji se na retro-viruse. Prisjetiti da retrovirusi genom sadrži dva identična jednostruku uzvojnicu RNA molekule, od kojih svaka se sastoji od šest dijelova: dva long terminal repeat (LRT) na 5` i 3` završava nekodirajuće sekvence * P + potrebnih za pakiranje RNA u virusnu česticu, te tri regije koje kodiraju strukturne proteine unutarnjeg kapsidni (gag) reverzne transkriptaze (POL) i proteina ovojnice (env) (Sl. 3.17 a).

Sl. 3.17. Genetski karte tipične retrovirusa (a) i retrovirusni vektor kartu (a)

Prisjetiti da retrovirus životni ciklus obuhvaća sljedeće korake:
1. Infekcija ciljne stanice.

2. Sinteza DNK kopije genoma s izvornim reverzne transkriptaze.
3. Prijevoz virusne DNK u jezgru.
4. integracija virusne DNA u kromosom stanice domaćina.
5. Aranžman mRNA iz virusne DNA pod kontrolom promotora jake lokaliziran na 5`-LTR dijela.
6. Prijenos proteine gag, pol i env.
7. Formiranje viralne kapsidne i paket dva RNA molekula lanaca i reverzne transkriptaze.
8. izdanje virionima iz stanice.

U pripravi retrovirusa duljine vektora DNA retro virusa umetnut u plazmid se uklonila većina gena gag i potpuno su geni pol i env, a umjesto toga je umetnut „terapijski”, gen V i opcijski marker selektivan Rg gen s vlastitog promotora (Sl. 3.17, b ). Uređaj T gen će biti pod kontrolom istog jaki promotor lokaliziran na 5`-LTR dijela. Na temelju ove sheme pruža razne retrovirusnih vektora i maksimalnu veličinu DNK umetak od oko osam tisuća. BP

Tako dobivena struktura može se koristiti samostalno za transformaciju, ali njegova učinkovitost i naknadna Integracija u genom stanice domaćina je izuzetno niska. Dakle, tehnika pakiranje ukupna RNA retrovirusni vektor u netaknutim virusnih čestica je razvijen, koji s visokom učestalošću u stanicu i prodrijeti zajamčena integriran u genom domaćina. Za ovu tzv „pakuyuschaya” stanične linije osnovana. Dvije različite dijelovi kromosoma stanica prošivene retrovirusne gena, gag i pol-env, lišene mogućnosti za pakiranje zbog nedostatka dosljednosti + (84 * +) (Sl. 3.18).

Sl. 3.18. Shema za dobivanje pakiranog virusni vektor

To jest, oba od tih fragmenata prepisuju, ali u isto vrijeme lišeni RNA praznih capsids. Transfekcijom RNA virusni vektor u takvim stanicama je uključena u kromosomske DNA transkribira, a da se dobije RNA retrovirus pune duljine, a pod tim uvjetima pakiranih u capsids od samo vektor RNA (samo sadrži sekvencu +). Rezultirajući intaktni čestice virusa koriste se za učinkovitu isporuku retroviralnog vektora u ciljnu stanicu.

Retrovirusi samo zaraziti aktivno diobu stanica opsežno. Prenijeti njihovi geni se pomiješa s pročišćenim čestica pakiranog retroviralnog vektora ili ko-kultivirane s staničnoj liniji ih proizvodi i zatim izvršiti odabir za razdvajanje ciljnih stanica i stanica pakiranja.

Transduced stanice su temeljito provjeriti razinu terapijske sintezu genske proizvoda, nepostojanje nadležnog replikacije retrovirusa, nema promjena na sposobnost stanica za rast ili funkciju.

Posebno prikladan za gensku terapiju su stanice koštane srži. To je zbog prisutnosti totipotentne embrionalnih matičnih stanica, što može proliferaciju i diferencijaciju u različitim tipovima B- stanica i T limfocita, makrofaga, eritrocitima, trombocitima i osteoklasta. Te stanice se koriste za liječenje brojnih nasljednih bolesti, a među njima smo već spomenuli teške kombinirane imunodeficijencije, Gaucherovabolest, anemija srpastih stanica, talasemija, osteoporoze i drugih.

Osim totipotentne matičnih stanica koštane srži koje je teško izolirati i kultivirati korištene pupovinnoy matičnih stanica iz krvi (poželjnu upotrebu genske terapije za dojenčad) i jetrenih stanica - hepatocitima - za tretman hiperkolesterolemije.

U in vivo genske terapije je posebno važno da se osigura isporuku terapeutskog gena u stanice neispravne. Takva ciljana isporuka može pružiti modificirani vektora koji se temelje na viruse koji mogu zaraziti određene vrste stanica. Razmislite pristup razvijen za liječenje već gore cističnom fibrozom spominje. Budući da su pluća su otvorene šupljine, terapijski geni dostaviti ih je relativno lako. Kloniranog varijanta zdravog gena je uveden u inaktiviranim adenovirusom (Sl. 3.19). Specifičnost ove vrste virusa je da se inficira sluznice pluća, što uzrokuje prehladu.

Sl. 3.19. Shema za dobivanje vektora na temelju adenovirus

Dizajniran tako da je virus testiran raspršivanjem u nos i pluća eksperimentalnih životinja i onda ljudi bolesnika. U nekim slučajevima, postoji uvođenje i izraz zdravog gena, i obnovi normalnog prometa kloridnih iona. Možda je ovaj pristup (uvođenje normalnim genom putem nazalnog aerosola) u bliskoj budućnosti će se naširoko koristi za liječenje simptoma cistična fibroza u plućima.

Osim retro i adenovirusi u genskoj terapiji pokusa na korištenje i drugim vrstama virusa, kao što su herpes simplex virusa. Značajka ovog dvostruke uzvojnice (152 tisuća. BP) DNK virusa je njegova sposobnost da posebno pogoditi neurona. Postoje mnoge genetske bolesti koje pogađaju središnji i periferni živčani sustav - tumori, metabolički poremećaji, neurodegenerativnih bolesti (Alzheimerove bolesti, Parkinsonove bolesti).

Herpes simplex tip virusa I (HSV) je vektor vrlo prikladni za liječenje takvih bolesti. Kapsidni virusa spaja se sa membranom od neurona, a njezina DNA prenosi u jezgru. To sugerira nekoliko načina prijenosa terapeutskog gena preko HSV-vektora i uspješno testiran u eksperimentalnih životinja.

Virusni vektori imaju nekoliko nedostataka: visoka cijena, ograničen kapacitet kloniranih i mogućih upalnih reakcija. Dakle, u 1999. godini, kao rezultat koji se razvio neobično jak imuni odgovor na vektor adenovirusa je ubijen 18-godišnji volonter koji je sudjelovao u ispitivanjima lijekova. U 2002. godini, dvoje djece u Francuskoj tijekom liječenja imunodeficijencije (uvođenje terapijskih gena u matične stanice uporabom retrovirusa) razvila je stanje slično leukemije.

Stoga je razvio neviralnu sustav za isporuku gena. Najlakši i neučinkovit način - to je injekcija plazmida DNA u tkivo. Drugi pristup - je bombardiranjem mikroprojektilima tkanine zlata (1-3 mikrona), konjugirani DNA. Tako terapeutski geni su izraženi u ciljnim tkivima i njihovim proizvodima - terapijskih proteina - ući u krvotok. Glavni nedostatak ovog pristupa je prerano inaktivacija ili uništenja tih proteina s krvnih pripravaka.

Isporuka DNK može postići to pakiranje u umjetnom lipida membrane. Tako dobiveni kuglaste čestice, liposomi se mogu lako probiti kroz staničnu membranu. Liposomi izrađen s različitim svojstvima, ali za sada djelotvornost takve isporuke je niska, jer je većina DNK je podvrgnut lizosomskog degradaciju. Sintetizirani DNA konjugata za raspodjelu genetskog konstrukta na različite molekule sposobne osigurati njegovu sigurnost, ciljano i prodiranje u stanicu.

U posljednjih nekoliko godina, intenzivni eksperimenti stvoriti umjetni kromosom 47, što bi omogućilo da se uključi veliku količinu genetskog materijala s punim skup regulatornih elemenata za jednog ili više terapijskih gena. To bi bilo moguće koristiti genomske verziju terapeutskog gena i time osigurati njegovu stabilnost i djelotvorno dugoročnu izraz. Eksperimenti su pokazali da je stvaranje umjetnih ljudskih kromosoma koji sadrže terapijskih gena je realan, međutim, nije jasno kako se takav ogroman molekula uvodi u ciljne stanične jezgre.

Glavni problemi s kojima se suočavaju genske terapije, uz rizik od teških imunoloških reakcija su teško dugotrajnu pohranu i rad terapijske DNK u tijelu pacijenta, mnogi multigenskim bolesti, što ih je teško ciljati za gensku terapiju, a rizik od upotrebe virusa kao vektora.

NA Ratnika, TG Volova

Dijelite na društvenim mrežama:

Povezan