Laboratorijske metode istraživanja. proteinurija

Video: laboratorijska istraživanja: hematologiju

sadržaj

Video: laboratorijska istraživanja: hematologiju

Bubrežna (istina) proteinurija
Izvanbubrežnim (false) proteinurija

Određivanje proteina u urinu

Određivanje dnevnog proteinurije
K = (x·-v) / 1000

Selektivna proteinurija
&beta2-mikroglobulinje
Prosječne molekula krvi i urina
Neplazmennye (tkiva) uroproteiny
Proučavanje enzima u krvi i urinu
Bence-jones protein

Male količine proteina se nalaze u dnevnom urinu zdravih pojedinaca. Međutim, takve niske koncentracije ne može se detektirati konvencionalnim metodama istraživanja. Izolacija veće količine proteina za koje su konvencionalne kvalitativni testovi za bjelančevine u urinu postati pozitivna, naziva proteinurije. Razlikovati bubrega (pravi) i izvanbubrežnim (lažnu) proteinuriju. Bubrežne proteinurije proteina u urinu prodire izravno iz krvi zbog povećanja njegove filtriranje ili smanjenje bubrežastih glomerula cjevasti resorpcija.

Bubrežna (istina) proteinurija

Bubrežne (pravi) proteinurija funkcionalan i organski. najčešće promatrana nakon svoje vrste među funkcionalnog bubrega proteinurije:

- fiziološke proteinurija dojenčad koja nestaje na 4 do 10 dana nakon rođenja, i preuranjenih kasnije;
- ortostatska albuminurije, što je tipično za djecu od 7-18 godina, a pojavljuje se samo u okomitom položaju tijela;
- prolazan (moždani udar) albuminurije, što može biti uzrok raznih bolesti probavnih organa, anemije, opeklina, ozljeda ili fizioloških čimbenika teške vježbe, hipotermija, jake emocije, obilje, bogate proteinima hrane i drugih.

Organski (bubrežni) proteinurija opaža zbog prolaska proteina iz krvi kroz oštećeni dijelovi endotelnih bolesti glomerularne bubrega (glomerulonefritis, nephrosis, nefroskleroza, amiloidoza, nefropatija trudna), poremećaji bubrega hemodinamike (bubrežne vensku hipertenziju, hipoksija), trofičkih i toksične (uključujući uključujući i lijekove) učinci na glomerularnim kapilarne zidove.

Izvanbubrežnim (false) proteinurija

Izvanbubrežnim (lažna), u kojoj je proteinurija izvor proteina u urinu je smjesa leukocita, eritrocita, bakterija, urotelijalnih stanica. uočeno tijekom urološke bolesti (urolitijaze, bubrežne tuberkuloze, bubrega i mokraćnog sustava tumora, i slično).

Određivanje proteina u urinu

Većina kvalitativnih i kvantitativnih metoda za određivanje proteina u urinu na temelju svog koagulacije volumena urina ili na granici faza (a) kiselinske urina.

Dodatni kvalitativne metode za određivanje u urinu bedka najčešće standardizirani test s benzojeva kiselina i prstenastim uzorka Geller.

Standardizirani test s sulfasalitsilovoy kiseline vrši se na slijedeći način. Dvije cijevi se prelije na 3 ml filtrira urina. Jedan od njih je dodano 6-8 kapi otopine 20% sulfasalitsilovoy kiseline. Na tamnoj pozadini uspoređuju obje cijevi. Zamućenje urina u cijevi s sulfasalitsilovoy kiseline ukazuje na prisutnost proteina. Prije studije je potrebno odrediti reakciju urina, a ako je alkalni, zatim se zakiseli s 2-3 kapi 10% -tne otopine octene kiseline.

Geller uzorka temelji se na činjenici da je prisutnost proteina u urinu na sučelju dušične kiseline i koagulacije urina događa i to se pojavljuje bijeli prsten. U epruveti se ulije 2,1 ml 30% -tne dušične kiseline i blago nanese na stijenku cijevi je isti iznos filtrira urina. Pojava bijelog prstena na granici dva fluida ukazuje na prisutnost proteina u urinu. To treba imati na umu da ponekad bijeli prsten s velikim brojem urata, ali za razliku od proteina čini prsten malo iznad granice između dvije tekućine i otopljen uz zagrijavanje [Pletnev NG 1987].

Kvantitativnih metoda se najčešće koriste:

1) Metoda jedinstvenog Brandberg-Roberts-Stolnikova, zgrada na prstenasti uzorku Geller;
2) Postupak fotoelektrokolorimetrichesky kvantitativno određivanje proteina u urinu magle koja se formira na dodavanje sulfasalitsilovoy kiselina;
3) Test biuret.

Identifikacija proteina u urinu pojednostavljenom ubrzanom metodom provodi kolorimetirijski metodom pomoću pokazivača papir, koji je proizveden od strane «Lachemu» (Slovačka), «Albuphan», «Ames» (Engleska), «Albustix», «Boehringer» (Njemačka), «Comburtest» i dr. način je uronjen u urin poseban papir trake impregnirane tetrabromfenolovym plave i citrat puferu, koji mijenja boju od žute do plave, ovisno o sadržaju bjelančevina u mokraći. Aproksimativna koncentracija proteina u ispitivanju urinu određen standardnim skali. Da biste dobili točne rezultate, sljedeći uvjeti moraju biti ispunjeni. urin pH mora biti u 3,0-3,5- suviše alkalnom urina (pH 6.5), lažno pozitivni rezultat se može postići, a kada je prekiseo za urin (pH 3,0) - lažno negativnih rezultata.

Rad treba biti u kontaktu s ispitivanom urina ne duži od navedenog u uputama, inače test će dati lažno pozitivne reakcije. Potonji je također promatrana kada je sadržaj u urinu velike količine sluzi. Osjetljivost različitih vrsta papira i serije mogu biti različiti, pa kvantitativna procjena proteina u urinu ovom metodom treba tretirati s oprezom. Određivanje njegove vrijednosti u svakodnevnom urinu pomoću testa papir ne mogu [Pletnev NG 1987]

Određivanje dnevnog proteinurije

Postoji nekoliko načina za određivanje količine proteina koja se oslobađa u urin po danu. Najjednostavniji način je Brandberg -Robertsa-Stolnikova.

Metodologija. 5-10 ml temeljito miješanje, dnevne urina izlije u cijev i stijenke svojih pažljivo doda 30% otopinu dušične kiseline. U prisutnosti proteina u urinu u količini od 0,033% (tj 33 mg po 1 litru urina) u 2-3 minuta pojavi suptilni ali jasno vidljiv bijeli prsten. Pri negativnog uzorka manje koncentracije. Na veći sadržaj proteina u urinu određen je količina urina ponavljana razrjeđenja destiliranom vodom sve dok dok se ne formira prsten. Konačna cijev, u kojoj je prsten uvijek vidljiv je koncentracija proteina će biti 0,033%. 0,033 množenjem stupanj razrjeđenja urina, sadržaj proteina se određuje u 1 l nerazrijeđenog urina u gramima. Tada izračunat sadržaj proteina u urinu dnevnom prema formuli:

K = (x·-V) / 1000

gdje K - količina proteina u dnevnim urina (g) - x - količina proteina u 1 litri urina (g) - V - količini urina dnevno dodijeljene (ml).

Inače, tijekom dana urin oslobađa od 27 do 150 mg (prosjek 40-80 mg) proteina.

Ovaj test omogućava da se odredi samo urin u redu proteina (albumina). Precizniji kvantitativne metode (kolorimetrijska metoda Kjeldahl i dr.) Su prilično komplicirani i zahtijevaju posebnu opremu.

U bubrega proteinurije u urinu albumin ističe, ne samo, ali i druge vrste proteina. Normalno proteinogramma ima sljedeću postotak (od strane autora Seitz, i sur 1953).: Albumina - 20%, &alfa₁-globulin - 12% &alfa₂-globulin - 17% &y - globulin - 43% &beta - globulina - 8%. Omjer albumina za globulin varira u različitim bolestima bubrega, tj poremećena kvantitativan odnos frakcije proteina.

Najčešće metode uroproteinov frakcioniranje su kako slijedi: soljenje neutralne soli, elektroforetsku frakcioniranje, imunoloških postupaka (a reakcija prema Mancini radijalni imunodifuzija, immunoelectrophoresis testu pretsipitatsionny immunoelectrophoresis), kromatografiju, gel filtracije i ultracentrifugiranje.

Uvođenje uroproteinov metode frakcioniranja na temelju proučavanja elektroforetskoj pokretljivosti, varijabilnost molekularne težine, veličina i oblik uroproteinov molekula, moguće je dodijeliti specifični za određene vrste bolesti proteinurija studije razmaci pojedinih proteina plazme. Trenutno su identificirani u urinu više od 40 plazma proteini, uključujući normalne urina na proteine plazme 31 [Berggard, 1970].

selektivna proteinurija

U posljednjih nekoliko godina, koncept selektivnosti proteinurije. 1955, Hardwicke i Squire formulirali pojam „selektivni” i „ne-selektivne” proteinurijom, određivanje da filtracija plazme proteina u urinu podliježe određenom obrascu: što je veća molekulska masa proteina izlučenog u urinu, manje od tla i niže koncentracije u konačni urina. Proteinurija odgovara ovaj uzorak je selektivni, za razliku od ne-selektivni, što je karakteristično za uzorke izobličenja izvedeni.

Detekcija proteina u mokraći s relativno velike molekularne težine pokazuje nedostatak selektivnosti bubrega filterom i izrazio svoju poraz. U tim slučajevima govorimo o niskom selektivnosti proteinurije. Stoga, u ovom trenutku raširenim određuju urina proteinskih frakcija uporabom tehnika elektroforeze na škrob i poliakrilamid gel elektroforeze. Rezultati tih istraživačkih metoda može biti suđeni na selektivnost proteinurije.

Prema V.S.Mahlinoy (1975), najviše opravdano je odrediti selektivnost proteinurije usporedbom razmaci 6-7 pojedinačne krvi proteine plazme (albumin, traneferrina, &alfa₂ - makroglobulin, IgA, IgG, IgM) pomoću precizne i specifične imunoanalize kvantitativne reakcije radijalne imunodifuzije prema Mancini i immunoelectrophoresis test pretsipitalnogo immunoelectrophoresis. Stupanj selektivnosti određen je indeksom selektivnosti proteinurije, predstavlja omjer referenca i u odnosu proteina (albumin).

Proučavaju razmaci pojedinih proteina plazme omogućuje dobivanje pouzdane informacije o stanju filtracija membranama bubrega glomerula. Veza između prirode proteina izlučuje u urinu i promjene u glomerularne bazalne membrane, a izražava se kao konstanta, koja uroproteinogramme posredno može suditi patofiziološke promjene u bubrežnom glomerula. Inače, prosječna veličina pora glomerularne bazalne membrane je 2,9-4 ° NM A koji se mogu preskočiti proteine koji ima molekularnu težinu od 10 do⁴ (Mioglobulin, kiselo &alfa₁ - glikoprotein, imunoglobulinski laki lanci, Fab i Fc - fragmenti IgG, albumin i transferin).

Glomerulonefritis, nefrotski sindrom veličina pora povećava u glomerularnih membranama, a time i bazalnih membrana postaje uglavnom propusna prema molekula bjelančevina velikih dimenzija i mase (ceruloplazmin, haptoglobina, IgG, IgA, i dr.). U ekstremnim bubrega glomerularne oštećenja u urinu pojavljuje div molekula u krvi proteine plazme (&alfa₂-makroglobulin, i IgM &beta₂-lipoprotein).

Definiranje urina proteina spektra, možemo zaključiti da je primarna lezija pojedinih dijelova nefrona. Glomerulonefritis, uglavnom utječu na glomerularne bazalne membrane karakterizira prisutnost u urinu srednjih i proteina. Za pijelonefritisa, prvenstveno utječe na bazalnu membranu tubula karakterističnih krupnomolekulyarnyh odsutnosti i prisutnosti povećane količine proteina srednje i male molekularne težine.

&beta₂-mikroglobulinje

Osim poznatih proteina, kao što su albumin, imunoglobulin, lipoproteine. fibrinogen, transferin, urin sadrži proteine plazme, uključujući mikroproteiny kliničke interesa &beta₂-mikroglobulin otvoren Berggard i Bearn 1968. Nakon niske molekularne mase (relativne molekulske mase 1800), prolazi slobodno kroz glomerula bubrega i gotovo u potpunosti apsorbira u proksimalnim tubulima. To omogućuje korištenje kvantitativni definicije &beta₂-mikroglobulin u krvi ili urina za određivanje brzine glomerularne filtracije i bubrežni resorpcije sposobnost proteina u proksimalnim tubulima.

Koncentracija proteina u plazmi i urinu određen radioimunoanalizom primjenom standardnog skupa «Phade-Bas &beta₂-mikroiest »(tvrtka "Pharmasia", Švedska). Kod zdravih pojedinaca serum sadrži u prosjeku 1,7 mg / L (raspon 0,6 do 3 mg / L) u urinu - prosjek 81 mg / l (maksimalno 250 mg / l) &beta₂-mikroglobulinje. Višak urina u svojoj iznad 1000 ug / l - patološki fenomen. sadržaj &beta₂-mikroglobulin u krvi povećava kod bolesti povezanih s oštećenjem glomerularne filtracije, posebno u akutnoj i kronični glomerulonefritis, bolesti policističnih bubrega, nefroskleroza, dijabetička nefropatija, akutno zatajenje bubrega.

koncentracija &beta₂-mikroglobulin mokraćom je povećana kod bolesti koje su povezane s poremećajem funkcije reabsorbtsionnoy tubula, što dovodi do povećanja izlučivanja svojoj u urinu u 10-50 puta, osobito u pijelonefritisa, kroničnog zatajenja bubrega, gnojni intoksikacije et al. Karakteristično, cistitis razliku ne pijelonefritisa opaženo povećanje koncentracije &beta₂-mikroglobulinje u urinu, koji se može koristiti za diferencijalnu dijagnozu tih bolesti. Međutim, prilikom tumačenja rezultata istraživanja treba uzeti u obzir da je svako povećanje temperature je uvijek u pratnji povećanje izlučivanja &beta₂-mikroglobulinje u mokraći.

Prosječne molekula krvi i urina

Prosječna molekula (SM), inače nazivaju proteinima toksina tvari s molekularnom težinom od 500-5000 daltona. Njihova fizička građa je nepoznat. Struktura CM se sastoji od najmanje 30 peptida: promatra oksitocin, vazopresin, angiotenzin, glukagon, adrenokortikotropni hormon (ACTH), itd prekomjernog nakupljanja CM sa smanjenjem funkcije bubrega i sadržaja u krvi veliki broj deformirane proteina i njihovih metabolita .. Oni imaju raznoliku biološku aktivnost i neurotoksičnosti sekundarni uzrok imunosupresija, sekundarne anemije, inhibira biosintezu proteina eritropoeze i inhibira aktivnost mnogih enzima koji narušavaju faze upale.

SM razina u krvi i urina screening ispitivanja određuje, te spektrofotometrijski na ultraljubičasto području valnih duljina od 254 mm i 280 spektrofotometra CI-8B i dinamičkog spektrofotometrijski s obrade podataka u 220-335 nm valne duljine u istom tvrtke Beckman spektrometru , Tijekom normalnog primanje sadržaja CM krv jednak 0,24 ± 0,02 USL. jedinica, te u urinu. - 0312 ± 0,09 konv. u
Kao normalan vijek organizma, koji su uklonjeni iz normalnog noći pomoću glomerularne filtracije na 0,5% - 5% od koristi drugi. Sve frakcije sm izložen cjevasti resorpcija.

Neplazmennye (tkiva) uroproteiny

Osim proteina plazme u krvi, u urinu se neplazmennye (tkiva) proteina. Prema Buxbaum i Franklin (1970), neplazmennye proteini čine oko 2/3 svih urina i biocolloids uroproteinov značajnim dijelom na patološke proteinurije. Tkiva proteini padaju izravno u urinu od bubrega ili organa anatomski su povezani s urinarnom traktu, odnosno pad od ostalih organa i tkiva u krv, i odatle kroz membranama bubrega glomerularnim - u urinu. U potonjem slučaju, izlučivanje proteina u urinu uklanjanja tkiva nastaje analogno na proteine plazme različitih molekulskih masa. Sastav neplazmennyh uroproteinov vrlo raznolike. Među njima, glikoproteini, hormoni, antigeni, enzimi (enzimi).

Tkiva proteini detektirani su u urinu konvencionalne metode kemije proteina (centrifugiranjem, gelu, elektroforezu, razne izvedbe), specifične odgovora na hormona i enzima i imunoloških metoda. Potonji omogućuje također da se odredi koncentracija neplazmennogo uroproteina u urinu, au nekim slučajevima utvrditi strukture tkiva, koje su postale izvor njegove pojave. Osnovni postupak za detekciju proteina u urinu se neplazmennogo imunodifuzije analiza s antiserumom dobiven imunizacijom eksperimentalnih životinja i urinu isušen (adsorbiran) u kasnijim proteine plazme.

Proučavanje enzima u krvi i urinu

Kada se proces bolesti primijetio duboke oštećenja vitalnih stanica, u pratnji oslobađanje unutarstaničnih enzima u okoliš tekućine u tijelu. Enzimodiagnostika se temelji na definiciji niza enzima koji su izdvojeni iz stanica oštećenih organa i nisu svojstveni serumu.
Istraživanje nefrona ljudi i životinje su pokazale da su neki od njegovih dijelova imaju visok diferencijaciju enzima, usko povezani s funkcijama koje obavljaju svakog odjela. U bubrezima glomerula sadrži relativno mali broj različitih enzima.

Bubrežnih kanalića stanice, osobito proksimalno sadrži najveći broj enzima. Njihova visoka aktivnost opažena u petlju ravno, Henle tubula i prikupljanje kanala. Promjene u aktivnosti određenih enzima u različitim bolestima bubrega ovisi o prirodi procesa, težine i lokalizacije. Oni su promatrane prije morfoloških promjena u bubrezima. Od sadržaja različitih enzima jasno lokaliziran u nefrona, definicija određenog enzima u urinu može doprinijeti lokalnu dijagnostici patoloških procesa u bubrezima (glomeruli, kanalići, kortikalna i žlijezde), diferencijalna dijagnoza bolesti bubrega i odrediti dinamiku (prigušivanje i pogoršanje) postupak u bubrežne parenhim.

Duljina diferencijalna dijagnoza bolesti urogenitalnog sustava koristi se za određivanje aktivnosti u krvi i urinu slijedeće enzime: laktat dehidrogenaze (LDH), leucin aminopeptidaze (LAP), kisele fosfataze (AP), alkalne fosfataze (ALP), &beta -, glukuronidaze, glutaminska-oksal transaminaze (GSCHT) aldolaza transamidinase itd Enzimska aktivnost u serumu i urinu određen spektrofotometrijski, biokemijskim, kromatografije, Fluorimetrijska i kemiluminiscentne metodama.

Enzimuriya bubrežne bolesti izraženije i prirodno, nego enzimemiya. Posebno je jako izražen u akutnoj fazi bolesti (akutnog pijelonefritisa, traume, propadanja tumora, infarkta bubrega, itd). U tim bolestima otkrivene transamidinase visoku aktivnost, LDH, alkalne fosfataze i KF, antibiotik, krila i nespecifična enzime poput GSCHT, katalaze [Polyantseva LR 1972].

Selektivni lokalizacija enzima u nefrona nakon detekcije LAP i alkalne fosfataze u urinu pouzdano reći akutnih i kroničnih bolesti bubrega (akutno zatajenje bubrega, bubrežni tubularne nekroze, kronični glomerulonefritis) [1968] Shemetov VD. Prema A.A.Karelina i L.R.Polyantsevoy (1965) transamidinase sadrži samo dva tijela - bubrega i gušterače. To je mitohondrijski enzim i bubrega u normalnom krvi i urina odsutan. U raznim bolestima bubrega transamidinase pojavljuje u krvi i urinu, te u lezijama gušterače - samo u krvi.

Ispitivanje razlika u dijagnostici i glomerulonefritis pijelonefritis Krotkiewski (1963) smatra aktivnost alkalne fosfataze u mokraći, povećanje, što je više tipično za pijelonefritisa i dijabetičke glomeruloskleroze nego za akutnu i kroničnu nefritisa. Povećanje dinamike amilazemiya dok smanjenje amylasuria može ukazivati nefrosklerozu i bubrežni ožiljaka, LAP ima najveću vrijednost na patološke promjene u glomerulama i savijenih tubula bubrega, jer je njegova koncentracija u tim dijelovima nefrona visokog [Shepotinovsky VP et al., 1980]. Preporučena definicija za dijagnosticiranje lupus nefritis &beta - glukuronidaze i CF [Privalenko MN et al., 1974].

Pri ocjeni uloge enzimurii u dijagnostici bolesti bubrega treba uzeti u obzir sljedeće odredbe. Enzimi, biva inherentno bjelančevine s malom molekulskom masom mogu proći kroz neoštećenu glomerula, definiranje tzv fiziološku enzimuriyu. Među tih enzima stalno utvrđuje u mokraći &a - amilaze (relativna molekulska masa 45 Ltd.) i uropepsin (relativna molekulska masa 38.000).

Uz enzimi niske molekularne težine u urinu zdravih osoba može se naći u malim količinama i enzima: laktat dehidrogenaze, aspartat i alanin aminotransferaze, alkalne fosfataze i KF, maltaza, aldolaza, lipaze, proteaze i različite peptidaze, sulfataza, katalaza, ribonukleaze, peroksidaza [King, Boyce 1963].

Visoke molekularne enzimi s relativnom molekulskom masom većom od 70000-100000, prema Richterich (1958.) i Hess (1962), mogu prodrijeti u mokraći samo u kršenje glomerularne propusnosti filtera. Uobičajeni sadržaj enzima u urinu ne isključuje patološki proces u bubrezima s uretre okluzije. Kada epzimurii mogući izlaz enzimi ne samo od samih bubrega, ali i iz drugih parenhima organa, sluznice stanica urinarnog trakta, prostate i urina formirana elemenata s hematurije ili leukocyturia.

Većina enzima nespecifično u odnosu na bubrege, dakle, odakle enzima pronađenih zdravi i bolesni u mokraći, teško je utvrditi. Međutim, stupanj enzimurii čak duljinu nespecifičnih enzima kada bolest bubrega viša od normalne, ili što se promatra u bolestima drugih organa. Za više vrijednih informacija može pružiti sveobuhvatna studija dinamike brojnih enzima, posebno organ-specifične, kao što su transaminaze.

U rješavanju problema bubrega porijekla enzima u urinu pomaže učiti izoenzima u identificiranju frakcije tipične istraživanog organa. Izoenzima - to enzimima djelovanjem izogeničnih (kataliziraju istu reakciju), a heterogena u kemijskoj strukturi i drugim svojstvima. Svaki materijal ima karakterističan za nju izoenzima spektra. Vrijedna izoenzima tehnike separacije su elektroforezom na škrob i poliakrilamid gel elektroforeza i kromatografija sa ionskom izmjenom.

Bence-Jones protein

U multiplog mijeloma i Waldenstromovu makroglobulinemije u urinu otkrivena protein Bence Jones. Postupak otkrivanja spomenutog proteina u urinu se temelji na reakciji termopretsipitatsii. Ranije korištene metode kojima se otapanje proteina je procijenjena na temperaturi od 100 ° C, a nakon toga uz taloženje hlađenje, nepouzdano, budući da nisu svi proteinski tijela Bence Jones imati odgovarajuća svojstva.

Pouzdaniji detekcija paraprotein precipitiranjem pri temperaturi od 40 -60 ° C Međutim, u tim taloženja uvjetima ne može dogoditi previše kisela (pH < 3,0—3,5) или слишком щелочной (рН > 6,5) моче, при низкой ОПМ и низкой концентрации белка Бенс-Джонса. Наиболее благоприятные условия для его осаждения обеспечивает методика, предложенная Patnem: 4 мл профильтрованной мочи смешивают с 1 мл 2 М ацетатного буфера рН 4,9 и согревают 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белка Бенс-Джонса в течение первых 2 мин появляется выраженный осадок.

Kada je koncentracija proteina Bence Jones manje od 3 g / l uzorka može biti negativan, ali u praksi to je vrlo rijetko, jer je njegova koncentracija u urinu je uglavnom značajniji. Na testu s kipućom ne može se u potpunosti oslanja. Sa sigurnošću se može detektirati u urinu imuno-elektroforetska metoda koristeći specifične seruma protiv teških i lakih imunoglobulinskih lanaca.

NA Lopatkin

Dijelite na društvenim mrežama:

Povezan