Polarizacije metode fluorescencije protutijela. Korelacija imunoglobulina

Kao odgovor na pitanje o postojanju nezavisne rotacije podjedinica imunoglobulina velika pomoć je metoda fluorescentne polarizacije. Osnovni pristup koji je korišten u ovim eksperimentima za proučavanje imunogiobuiina fleksibilnosti sastojala u usporedbi s eksperimentalno određenim vremenskim korelaciju molekula imunoglobulina, pronađen u eksperimentu karakterizira vremenski molekulu ravninu polariziranog svjetla, s vremenom korelacije izračunat na pretpostavci da je krutost molekule.

Dakle, ako pretpostavimo da je molekula IgG krute elipsoid osima rotacije sa omjerom 1: 2 i molekularne težine od 150.000, korelacija vrijeme molekule mora biti jednaka 73 nsec i eksperimentalno promatrati, to je obično mnogo manji: 20-40 nsec. To ukazuje na sposobnost fragmenata u nezavisnom relativnog kretanja a time fleksibilnih povezujućih dijelova polipeptidni lanac. Slični podaci dobiveni su spina naljepnice.

Trkač na duge staze i Griffith (Stryer, Griffith, 1965) za određivanje vremena korelaciju spin-obilježenog haptena vezan na antitijelo, proučavali ponašanje tvari sadrži i skupinu fluorokromom, oznaku centrifugiranje i drugačiji viskoznosti otopine.

Promjenom viskoznost otopina dodavanjem glicerola, postignut njegov EPR spektar odgovara sa spektrom spin-označene hapten veže na aktivno mjesto. Zatim je metoda fluorescentne polarizacije određuje vrijeme korelacije. Tako nađeno korelacija vrijeme N-O skupina povezana rotaciju označen hapten nađeno je da 12 nsec. Autori ispravno, imajte na umu da je ova vrijednost može biti preniska u odnosu na povezanost Vrijeme Fab-fragment, budući da se ne može isključiti mogućnost rotacije prstena u odnosu imminoksilyyugo dinitrofenil grupe, čvrsto povezan s aktivnim centra. Ovaj nedostatak je zajednički za sve pokušava odrediti vrijeme korelacije IgG Fab fragmenta Spin-označene hapten.

">

Hsia i Piette (Hsia, Piette, 1969) za određivanje vremena korelaciju povezan s aktivnom središtu spin-obilježenim haptenom umjeravanje ovisno o viskoznosti EPR spektara spina oznaka otopine. Vrijeme korelacija odgovara određenom rasponu, određuje Stokes' zakon - Einstein, s obzirom da je učinkovita Stokes radijus oznaka je 5 A. Najkraći spin-označene hapten najviše čvrsto vezana za aktivno mjesto, imao korelacija vrijeme 39 nsec.

Dweck i suradnici (Dwek npr. a., 1975a) izračunato korelacija vrijeme spin-obilježenim DNP lokaliziran u aktivne centre IgA (MOPC 315) i te Fv FAB-fragmsntov. Utvrđeno je da je 44,4, 23 i 6,5 nsec, respektivno.

dobiti zečja protutijela izravno na rotaciju oznaka 2,2,6,6-tetrametilpiperidm-4-amino (N-diklortriazina) služio imunizacijom s haptena. Rezultat stvaranja specifičnog kompleksa antitijela i peptički fragmenata papannovyh sa spina oznaka ima jaku imobilizaciju. Miješanje odgovarajuće količine rješenja nespecifična kunića IgG i oznake slični uvjeti rezultirali samo u izgledu EPR spektra slobodnog etiketi. Korelacija Vrijeme oznake izračunate Shimshiku i McConnel (Shimshick, McConnell, 1972). nađeno je da je 32, 30 i 18 respektivno nsec za komplekse spina oznaku s protutijelom, poliklonskim i Fab-fragmenata u izoelektrične točke (pH 6.3).
Dobivene vrijeme vrijednosti korelacija IgG u Fab-fragmenata i potvrđena u navedenom članku.

Razlike u vremenu korelacija, Dobije za Fab-fratmenta kao izolirani i dio F (ab) 2, a cjelovito protutijelo pokazuju ograničenja slobode rotacije Fab-fragmenata, podjedinica nametnuta reakcijom F (ab) 2 i IgG. Povećava temperatura rezultirala smanjenjem smanjena standardnim uvjetima (3 x 105 P / C), vrijeme korelacija naljepnice komplekse sa F (ab) 2 i IgG.

Očito, kada je zagrijavana sloboda relativno kretanje im podjedinica povećava. Mogućnost dobivanja protutijela na naljepnici spina, služio imunizacije s hapten je potvrđeno u drugoj studiji (Humphries, McConnell, 1976.).