Krv imuno test (RIA) primjena

U 1956 su prvi puta otkriveni u bolesnika liječenih inzulinom, nepretsipitiruyuschie protutijela sposobnih za vezanje ¹³¹I-inzulin. Zatim, ovo istraživanje je pokazalo da skupina obilježen inzulin natječe se s markiranim protutijelom za vezanje i potiskuje od imunih kompleksa. Nakon toga, Berson i Yalow razvili prvu metodu za mjerenje RIA koncentracije inzulin u serumu, za koje su dodijeljena Nobelova nagrada. U ovom postupku, inzulin vezan na antitijela se odvoji od nevezane inzulina papira elektroforezom. Otprilike u isto vrijeme, u 1960., Grodsky i Forsham opisuju isti postupak pomoću RIA ¹³¹I-inzulin, ali je odvajanje vezanog i slobodnog hormona, oni umjesto soljenje elektroforeza je upotrijebljen.

Ogromna doprinos razvoju RIA Hales i randle se 1963. odvojiti vezane i nevezane hormona oni koriste anti-y-globulin, takozvani sekundarnih protutijela. Taj pristup temelji se na radu i Skom Talmadge, koji je 1958. godine pokazao da sekundarna antitijela uzrokuje taloženje kompleksa „antigen-primarne”. Hales i Randle način, pod nazivom „metoda dvostrukog antitijela”, pokazao se mnogo više osjetljiv i specifičan od prethodnih verzija RIA.

1963., Herbert et al. Mi smo razvili tehniku ​​za odvajanje kompleksa „antigen-antitijelo” iz nevezanog antigen aktivni ugljen obložen sa dekstran. Metoda se temelji na imovinu dekstran smjese ugljena uglavnom odmah apsorbiraju slobodne antigen, a ne vežu sa kompleksa antigen-antitijelo. Ova tehnika omogućuje da se razdvoje imunosnih kompleksa mnogo byst7 sošnjak nego pretsipitatsionnye tehnike, tako da možete ga koristiti ¹³¹I-antigena niske specifične aktivnosti etikete Hunter i Greenwood.

Video: Naučite crtani Winx?

Istovremeno Utiger i sur. prošireni opseg primjene RIA, razvoju metode za kvantifikaciju ljudski hormon rasta. Kasnije Greenwood i sur. proveden postupak jodiranja STH, čime se dobije označenog hormona sa specifičnom aktivnošću 200- 500 mCi / mg (6 tisuća do 9 hiljada Ci / mmol).

Ova tehnika se još uvijek koristi i danas. Svojoj biti leži u činjenici da je jod izotop (1311 ili 1251), u sastavu natrijeva jodida je oksidirana pomoću kloramin T i u tom obliku zamjenjuje jedan ili više atoma vodika u fenilnom prstenu tirozin i histidina imidazolskog prstena. Nakon 1 min, reakcijska smjesa se doda redukcijsko sredstvo, kako bi se izbjegla šteta na hormon. Imajte na umu da načelo oksidacijskog jodinacije proteina opisan je u Hughes 1957. U daljnjoj Meyer Knobil i razvijen za mjerenje RIA u majmunski i ljudski hormon rasta, naznačen time što je aktivni ugljen koji se koristi za odvajanje nevezanog hormona.

Porijeklo RIA za mjerenje razine gonadotropski hormona (u ovom slučaju - LH), razvijenim u 1966, na temelju upotrebe antitijela na humani CG, jer je ranije pokazano da ta antitijela se vežu za ljudska i LH. Jedan od eksperimenata na ovom području je napravio pravu revoluciju u imunokemija: Catt et al. Otkrili smo da su protutijela u stanju pridržavati diskovima diazotiraju polistirena. Tako, eliminira potrebu za odvajanje kompleksa kompleksa antigen-antitijelo precipitacijom ili adsorpcija. Kasnije Catt i sur. naučili imobiliziranog antitijela direktno s nezasićenim polistiren u lužnatom mediju. Rezultati ovih istraživanja je služio kao osnova za stvaranje ELISA (vidi, dolje). Faiman i Ryan po prvi put uspjeli dobiti serum za hipofize gonadotropin - humani LH. Nakon toga RIA za određivanje LH štakora su razvijeni.

Razvoj RIA mjeriti razinu FSH, kao u slučaju LH, počnite s okom na budućem kliničkom istraživanju. U 1967 i 1968. nekoliko istraživačkih grupa izvijestili o novim metodama RIA za različite oblike ljudskog FSH. Svi oni su se temeljile na metodi dvostrukih antitijela.

Godine 1967., Aria i Lee po prvi put najavio postupak za određivanje prolaktina, temelji se na metodi dvostrukih antitijela. Prvo mjerenje razine prolaktina RIA su provedena u odsutnosti humanog materijala u ovaca i goveda plazme.

Teorijski temelji RIA

Prva RIA metode (npr metode Berson i Yalow ili Grodsky i Forsham) temelje se na fenomen kompetitivnom inhibicijom. Ovaj fenomen leži u činjenici da je vezanje izotopa-obilježenog hormona (tragača antigenom) sa specifičnim protutijelima inhibira u prisustvu neobilježene hormona (antigen neoznačenog). Fenomen kompetitivnom inhibicijom mogu se opisati dvije jednadžbe: „obilježeni antigen + antitijelo kompleks je označen‘i’antigen neoznačenog + antitijelo <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Tipično RIA na 4 ili 37 ° C, u fosfatno puferiranoj fiziološkoj otopini pri pH 7 ili 8. Reakcija može trajati od 2 do 24 sata (ovisno o afinitetu antitijela i željene razine osjetljivosti). Imajte na umu da automatizaciju analize i poboljšane metode proizvodnje protutijela značajno smanjuje vrijeme reakcije. Kad se reakcijska smjesa, ravnoteža se uspostavlja, kompleksa antigen-antitijela se odvoje taloženjem sa sekundarnim antitijelima, antigene i apsorpcije slobodnih antitijela na aktivnom ugljenu ili precipitacijom u mediju velike gustoće, kao što je polietilen glikol. Ako krutoj fazi RIA, inkubacijski medij se lako ukloni, a antigen-antitijelo kompleksi ostaju polistirena ili druge čvrste faze. U posljednjem koraku radioaktivnost kompleksa. Ako je hormon označena ¹²⁵I ili ¹³¹I, upotrebom zračenja suprotnom, ako je oznaka služio 3H, čestice primjenom scintilacijskog brojača. koncentracija hormona u uzorcima su izračunate iz baždarne krivulje pripravljen iz mjerenja u standardnim uzorcima s poznatim koncentracijama od hormona.

Priprema antitijela

Poliklonska antitijela su pripravljena od imunizacije RIA antigen (hormon) životinje različitih vrsta, uključujući i kunića, kokoši, patke, zamoraca, ovce i koze, Za primarnog antitijela (anti-hormona) se obično koristi u kunića i zamorci za sekundarno antitijelo (anti-primarne) - ovce i koze.

Video: Alergije na psa pasmine pudl

Postoje mnoge metode imunizacije, najčešće - ubrizgavanje antigena u šapu, ili u regionalne limfne čvorove ili slezena. Budući da u domaćinu postoji antigeni za kratko vrijeme, za pouzdanu induciranje imunološke reakcije upotrebom Freundovo pomoćno sredstvo. Neimunogenih antigena niske molekulske mase (npr steroidnih hormona) i antigena niske imunogeničnosti prije imunizacije vezan na velike molekule ili čestica (metiliranom albumin, feritin, dekstran, i Sephadex m. P.). Cijepljenje se uglavnom izvodi u nekoliko faza s razmacima od 2 tjedna. Tipično, nakon nekoliko injekcija titra protutijela u serumu ubrzano raste. Krv za imuni serum uzeti iz šupljine srca ili vene i arterije uha. Potonji postupak se najčešće koristi kod kunića. Dobivena serum inkubiran 30 minuta pri 57 ° C da se uništi komplement. Tada je serum se dodaje konzervans da spriječi rast bakterija i gljivica (natrij azida ili timerosal).

monoklonska protutijela

Godine 1975, Kohler i Milstein razvili potpuno novi - hibride - tehnologije za proizvodnju antitijela. Kasnije, taj razvoj je dobio Nobelovu nagradu. Mi opisati glavne elemente ove tehnologije.

Miševi ili štakori su imunizirane s antigenom, kao što je hormon. Kad titar antitijela u serumu dobiva dovoljno visok u životinjama s imunološkim mjesto Zenk Izolirani plazma stanice, među kojima su stanice - proizvođača antitijela na početne antigen. stanice plazme in vitro hibridizira stanice mijeloma izvedeni životinje iste vrste. Suspenzija stanica se prenese u selekcijski medij u kojem samo hibridne stanice preživjeti, kao i u plazmi Nye mijelomske stanice nestaju. Hibridni stoje za jedan zasije u jažice klorovodične srednje izvoda gdje su podijeljeni i tvore hibridoma (besmrtne stanične linije) ,. Između većeg broja odabrati one hibridoma koje proizvode, antitijela željene antigen i umnožiti hranjivi medij, ili u peritonealnu šupljinu miševa sinergičkih. Od pitatelno- srednje ili ascites tekućine izolirane antitijela. Ova antitijela se nazivaju monoklonska jer su proizvodi hibridoma su potomci jedne plazme stanice. Monoklonska protutijela proizvode se korištenjem hibridoma prepoznajemo samo jednu epitopu antigena. To je osnovna razlika između monoklonskih antitijela od poliklonalnog antiseruma koja obično sadrži više različitih antitijela protiv različitih determinanti antigena.

Jedna od bitnih prednosti monoklonskim antitijelom poliklonalnim leži u činjenici da je ista vrsta monoklonskih antitijela s definiranim specifičnošću i afinitetom mogu proizvesti u bilo kojoj količini i gotovo beskonačne (kao besmrtne hibridom). Nasuprot tome, protutijela poliklonalnih antiseruma je vrlo promjenjivo, koje treba provjeriti svaku novu seriju antiseruma i odabira uvjeta njegove primjene. Tako, upotreba monoklonalnih antitijela puno lakše za standardizaciju RIA i druge Imunokemijske analize.

Dobivanje hormona, radioaktivno označeni

Kao što je već spomenuto, za iodization bjelančevina hormona najčešće koristi metoda predlaže Greenwood i Hunter. U početku se koristi kao oznaka ¹³¹Sam, ali zbog kratkog vremena poluraspada ovog izotopa (8 dana) rok trajanja označenog hormona bila mala. 1967., Wilde, i sur. koristi za iodization ¹²⁵I (T_1/2 60-dnevno). Od tada, izotop koristi za oznaku svakog proteina, a neke ne-proteinski hormoni. Tako dobiveni označen hormona sa specifičnim djelovanjem 100-250 mCi / mg. To je dovoljno za pouzdanu detekciju čestica u zračenja pulta.

Označavanja upotrebe hormona bez proteina i drugih radioaktivnih izotopa kao što je čestice radijatora ³H ili ¹⁴C. označen ³H ili ¹⁴C steroidi se koriste ne samo u imunokemijskom analizom hormona, ali u temeljnim istraživanjima endokrinološke, na primjer za proučavanje lokalizacije receptora steroida u različitim stanicama i tkivima eksperimentalnih životinja.