Dijagnostika predimplantacijsku gena

Njegova kombinacija sa testom za aneuploidije može poboljšati rezultate IVF-a. DNA za predimplantacijsku genodiagnostic pripremljen od polarnog tijela biopsiju stupnju drobljenja ili zigota biopsija blastocista.

DNA analiza se provodi na polarno tijelo postupka oocita faza II. Glavni nedostatak ove metode leži u činjenici da je, kako bi potvrdili genotipa embrija, prenatalna dijagnoza je potrebno. Rekombinacije kromosoma u 1. mejotske diobe može uzrokovati pogrešne dijagnoze. U većini centara obavljati embrija biopsiju, koja se može otkriti bolest, naslijeđena od oba roditelja. Biopsija materijal obično dobiven u koraku drobljenje zigoti (korak osam stanica) odabir stanica 1-2. Zbog poteškoća u svezi s dijagnozom na tako ograničenom materijala (vidi. Ispod), idealno bolje biopsija blastocista, jer sadrži i do 300 stanica. Osim toga, biopsija može uzeti stanice trofoblasta, jer su lako dostupne i to ne ometa pravilan razvoj embrija. Međutim, blastocista biopsija vrši ne u svim centrima zbog složenosti svog uzgoja stanica u kulturi i smanjen opstanak blastocista nakon zamrzavanja. Međutim, pomoću ove metode, moguće je postići trudnoću, a tijekom vremena, s iskustvom, njihova učinkovitost je vjerojatno da će rasti.

Dobiveni na biopsije materijal analiziran pomoću jednog od dva postupka: PCR ili fluorescentne hibridizacije in situ. Laboratoriji koji obavljaju takva ispitivanja mora imati certifikat u svom izvješću navesti koji postupak se koristi, kao rezultat dekodiranja rezultata. Ipak, stručnjak plodnost je izuzetno važno razumjeti molekularne i genetske metode predimplantacijsku genodiagnostic, njihova primjena i njihovih vlastitih nedostataka.

PCR

PCR je najprikladnija za dijagnozu monogenskih zabolevanij ga koristiti kako bi se utvrdilo je spol embrija je, iako će sada sve više koristi fluorescentnu hibridizacije in situ. Kako prepoznati pomoću PCR mutaciju u određenom genu, potrebno je prije IVF znati što tražiti mutacije, i unaprijed odaberite uvjeti reakcija. U svakom reakcije moraju biti uključeni u odgovarajućim pozitivnim i negativnim kontrolama, inače rezultati ne mogu vjerovati. Treba imati na umu da za vrijeme reakcije može biti broj izazova, uključujući:

1. odsutnost PCR produkta;
2. uzorak onečišćenje;
3. gubitak alela.

Osim toga, u mnogim centrima, ako planirate podnijeti zahtjev za pre-implantacije dijagnostičkom PCR, pribjegavaju intracitoplazmatskom ubrizgavanjem sperme, kako bi se izbjegle eventualne pogreške u dijagnozi uzrokovane uvođenjem transparentne korice dodatnih sperme.

Budući da je predimplantacijsku genodiagnostics broj predloška DNK za PCR nije dovoljno - obično nekoliko pikograma, a obično je u PCR sto nanograma se koriste, potrebno je povećati broj ciklusa pojačanja. Ako PCR DNA uzeti iz jedne stanice (ili više stanica) često zahtjeva 35-60 ciklusa, a standardni PCR (kada je količina uzorka nije ograničavajući faktor) - oko 30. Drugo rješenje je da se PCR s ugniježđenim prajmerima (ili jedan usidreni primer): dva uzastopna reakcije za amplifikaciju male količine ciljnog uzorka. U posljednjih nekoliko godina, koristili smo početnice s fluorescentnim markerom za analizu vrlo male količine DNA, čime se poboljšava osjetljivost PCR je oko 1000 puta i na taj način smanjiti broj ciklusa pojačanja.

Eliminirati kontaminacija uzorka treba biti vrlo pažljivo pripremljen i reakcijsku smjesu se drže reaktsiyu- toga, u reakciji uključuju negativnu kontrolu (reakcijska smjesa koja sadrži sve sastojke osim DNA). Ako je negativna kontrola produkt PCR je otkriven, mogućnost kontaminacije uzorka strane DNK - u ovom slučaju, PCR rezultati u ostatku uzoraka ne može biti pouzdana. Budući da je korištenje primera fluorescentnim markerom broja PCR krugova manja vjerojatnost kontaminacije ispod uzorka.

Gubitak alel znači da je pojačan u osnovi jedan od alela, dok je drugi pojačan vrlo slabo ili ne pojačan na sve. Očito, to ima najveću vrijednost u identificiranju bolesti s autosomno dominantnog nasljeđivanja. Ako je „izgubio” dominantni alel sadrži mutaciju, greška u analizi može dovesti do transfera embrija u šupljinu maternice sadrži mutirani gen. Moguče pojačati različite uskom DNA fragment koji ima visok stupanj polimorfizma (višestruki PCR) Da bi se izbjegla ovaj problem. Osim toga, kao što je već spomenuto, možete poboljšati osjetljivost PCR korištenjem primera sa fluorescentnim markerom.

Udruga predimplantacijsku genodiagnostics Europska grupa za humanu reprodukciju i embriologiju (ESHRE) ocijenila je dijagnostičku točnost PCR i fluorescentne hibridizacije in situ. Prema godina 1999-2001., U 81 predimplantacijsku genodiagnostic slučaju, nakon što je PCR je izvedena pomoću prenatalnog ili postnatalnog manjka diagnostika- naznačen time što je greška u dijagnostici bolesti se nasljeđuje mendelovski zakonima otkrivene u 5 slučajeva (6,2%). Ponovljeni dijagnostika kako bi potvrdili rezultate provedena je samo pola predimplantacijsku dijagnoze. Također je potrebno uzeti u obzir slučajevima u kojima je bilo nemoguće provesti biopsiju ili nemoguće dijagnosticirati.

Fluorescentna hibridizacija in situ

Ovaj postupak se sastoji u tome što je sonda (jednolančana DNA) koji nosi oznaku fluorescentnog, hibridizira DNA iz denaturiranog metafaze ploče, pojedine stanice ili tkiva. metoda se može koristiti u dijagnostici predimplantacijsku gena za:

1. embrija određivanje spola za X-vezani bolesti, postoji mogućnost da se provesti PCR;
2. detekcija kromosomske translokacije;
3. otkrivanja promjene u broju kromosoma;
4. otkrivanje drugih kromosomske aberacije, kao što su aneuploidija.

U studiji aneuploidije o mogućim tehničkim poteškoćama vezanim za definiranje broja kromosoma. Ako za analizu pojedinačnih međusloja stanice se uzimaju, teško je precizno odrediti broj signala (drugim riječima, kromosomi) kada issleduesh jedne jedine stanice. Ako vidite samo jedan signal, to može značiti monosomijom na tom kromosomu, ali i preklapanje signala ili da je sonda hibridizacije s jednom od kromosoma nije uspjelo. Slično tome, prisutnost tri ili više signala može značiti trisomijom, ali može biti zbog tehničkih problema: dvoslike signala ili abnormalno fluorescencije. Proširiti dijagnostički potencijal može primijeniti istovremeno najmanje tri sondi: na X-kromosom, Y kromosom i autosomima jedan od primjera 18. kromosoma. U tom slučaju, laboratorij mora uvijek biti strogo nadzirati kvalitetu hibridizacije na dijagnostičke točnosti je kao visok kao moguće, jer je poznato da se u proučavanju 100 normalne diploidne stanice 100 pari signala za svaki kromosom neće moći primiti. Dijagnostičke mogućnosti će se proširiti, ako će biti moguće analizirati veći broj stanica.

U ovom postupku detekcije translokacije obično koristi sondi okružuju translokacije ili pridržava položaju. Jer odmah nakon pripreme za IVF oocita polarne tijela sadrže kondenzirani metafaze kromosomske probe može se koristiti za „slika” kromosomima u kombinaciji s centromerni sonde na dijelove (a satelitske ponavljanja) i određenog lokusa. Nažalost, stanice iz cijepanja fazi zigote ili na blastociste fazi, takve probe su neprikladni jer kromosomi ne mogu biti u metafazi i nedovoljno spojeni. Postupak u kojem se koriste za probe subtelomerne područja kromosoma specifične kromosomske translokacije javlja između njih, a centromerni dio sonde, proksimalni u odnosu na mjesto translokacija. Takve sonde može otkriti u medufaznih stanice dekompenziranom translokacije, ali ne mogu razlikovati normalne kromosomu koje kromosoma translokacije s nadoknaditi.

Prema izvješću Udruge za predimplantacijsku genodiagnostics Europske grupe za humanu reprodukciju i embriologiju, fluorescentna in situ hibridizacija dao pogrešan rezultat u 8 slučajeva od 145, kada je nakon dijagnoze predimplantacijsku provodi prenatalnog ili postnatalnog (5,5%). Među pogrešne dijagnoze - dva slučaja trisomije, jedan mozaik trisomije, s monosomijom i jedan nadoknaditi i dekompenziranom translokacije. Osim toga, studija o aneuploidiju bio neotkriven trisomija kromosoma 21. Kao što je slučaj s PCR potvrdu fluorescentne in situ hibridizacije rezultata provedena je u manje od polovice žena koje su prošle kroz dijagnostiku predimplantacijsku gena.

Uloga fluorescentne in situ hibridizacije u određivanju translokacije danas nije jasno, jer 50-70% slučajeva, u kojima su roditelji nositelji kompenzirati recipročnih translokacije, kada embriji dekompenziranom studija translokacija. Ovi objavljeni podaci o incidenciji uspješnu trudnoću nakon studija znatno se razlikuju, ali prema podacima triju glavnih središta učestalosti trudnoće u smislu da jedno jaje je 29%. Neki autori su izvijestili da dijagnostika predimplantacijsku gena smanjuje rizik od spontanog aborta- ali je nejasno da li se povećava stopu uspješnog završetka trudnoće u usporedbi s prirodnom začeću, budući da više od polovice embrija će imati abnormalnosti, a time i veću vjerojatnost, u svakom slučaju, neće preživjeti. Unatoč činjenici da je dijagnostika predimplantacijsku gena za testiranje za aneuploidije je više puta koristi s IVF-a, nitko od objavljenih randomiziranih studija dokazano nije pokazala značajan porast broja uspješan ishod trudnoće. IVF sa predimplantacijsku dijagnozu - invazivna i skup postupak, tako da je važno da točno razgraničiti praktičnu ulogu ove metode.

Udruga za predimplantacijsku genodiagnostics Europske grupe za humanu reprodukciju i embriologiju

Izvući prave zaključke iz rezultata predimplantacijsku genodiagnostic provedenog PCR-om i fluorescentne hibridizacije in situ, u praksi, to je još uvijek nije uvijek moguće. Prema izvješću Udruge za predimplantacijsku genodiagnostics Europske grupe za humanu reprodukciju i embriologiju za 1999. do 2001 dvogodišnje razdoblje., Provedeno u 1197 ECO ciklusa kao što je prikazano u rezultatima naknadne prenatalna ili postnatalne dijagnostike, dijagnostika gena predimplantacijsku pomoću PCR dao pogrešan rezultat u 5% i uz uporabu fluorescencije hibridizacija in situ - 6% slučajeva. Također se smatra da nakon dijagnoze izvode manje od pola vremena, tako da je broj pogrešnih dijagnoza može biti preniska. Međutim, ti podaci ne znače da je u 94% slučajeva je napravio pravilnu dijagnozu. Prema Udruzi, ukupna stopa trudnoća nakon žetve jaja bio 17%, biopsija je bio uspješan u 97% slučajeva, dijagnoze i moći zadržati samo 86% slučajeva. Ukupno, to znači da je točna dijagnoza predimplantacijsku dijagnoza je napravio oko 85% slučajeva. Oni koji su o tome proći dijagnostiku predimplantacijsku gena, treba upozoriti da je u 15% slučajeva, točna dijagnoza ne može staviti.