Non-izotopne metode imunoanalize hormona

To je bio prvi metoda za precizno kvantitativno određivanje hormona, je naširoko koristi te je odigrao veliku ulogu u laboratorijskoj dijagnostici endokrinih poremećaja. Ona se temelji na suvremenim načelima formirana RIA imunoanaliza hormona. Međutim, u posljednjih dvadeset godina, RIA je gotovo u potpunosti eliminira iz kliničke prakse ne izotopa metoda imunološka - ELISA i immunohemilyuminestsentnym analize. Temelj ove metode, kao i u RIA temelji na interakciji antigena i antitijela, a koriste se kao oznaka neradioaktivnih izotopa, i enzima koji kataliziraju reakciju, čime se dobije proizvod u boji, ili luminiscentnog tvar. U prvom slučaju, konačna faza analiziranja optičku gustoću reakcijske smjese u drugom - broj fotona emitiraju luminiscentnog materijala.

Video: Regionalna laboratorijski i dijagnostički centar Imunokemijske metode istraživanja IHMI

imunosorpcije vezivanja

Za kvantitativno određivanje hormona najčešće koriste krute faze ELISA sa dva antitijela. Se provodi u plastičnim pločicama s više jažica. Na dnu jažice sorbira monoklonska antitijela specifična za određeni antigensku determinantu hormona. Jažice su uzorci seruma s nepoznatim koncentracijama hormona ili standardnim uzorcima s poznatim koncentracijama hormon. Ploča je inkubirana tijekom 30-120 min-tog vremena, hormonski molekule upravljanje za povezivanje s antitijelima adsorbirani na plastiku. Nakon inkubacije, jažice su isprane sa puferom da se ukloni nevezani hormona i druge komponente u serumu. Zatim se jamice dobivanje poliklonskih antitijela za hormon konjugiranim s peroksidazom (tzv konjugata) i ploča se inkubira tijekom 15-30 minuta. Naznačen time, da konjugat molekula veže na molekule hormona. Jažice se ponovno isperu da se ukloni nevezani konjugat i dodavati u otopinu koja sadržava supstrat peroksidaze bezbojna. Peroksidaza pretvara supstrat u obojeni proizvod. Intenzitet bojenja rješenja u jažice (je izmjerena u fotometru) izravno je proporcionalna količini konjugata u komore, a to je - koncentracija hormona. koncentracija hormona u uzorcima seruma izračunava iz baždarne krivulje pripremljene iz mjerenja koncentracija hormona standardnim uzorcima.

Treba naglasiti da je ova ELISA metoda, za razliku od gore opisanih RIA metoda je nekonkurentna. Činjenica da je u reakcijskoj smjesi odsutni obilježenog antigena i razinu vezanja poliklonskim protutijelom (konjugat) antigen adsorbira na monoklonska antitijela, ovisi samo o koncentraciji antigena u uzorku. Nekonkurentnih metode se koriste i kad immunohemilyuminestsentnom analiza.

Immunohemilyuminestsentny analiza

Mnoge opcije immunohemilyuminestsentnogo analizu. Mi ćemo opisati primjer izvedbe, koji se koristi za mjerenje razine gonadotropina u modernoj autoanalizatoru. U ovoj izvedbi, hormon se koristi za vezivanje paramagnetskih mikročestica prevučene s monoklonskim antitijelima specifičnim za visoko određenom hormona. Mikročestice su suspendirane u puferskoj otopini i dodana u suspenziju uzorcima seruma ili standardnim uzorcima. Nakon kratke inkubacije (10 min) 20 mikročestice s vezanog hormona taloži u magnetskom polju i ispere nekoliko puta. Zatim su mikročestice resuspendirane u puferu i doda se u suspenziju poliklonskih antitijela na hormon konjugatom s alkalnom fosfatazom. Nakon ispiranja nevezanog konjugata doda se u suspenziju mikročestica dioksetina fosfata. Pod djelovanjem alkalne fosfataze fosfata dioksetina nastaje emisijom dioksetin luminescencije zrake. Intenzitet luminescencije koja se mjeri pomoću fotomultiplajer, izravno je proporcionalna koncentraciji hormona u uzorku.

Video: Laboratorijska istraživanja

Metode za detekciju autoantitijela

Reproduktivne poremećaje može biti izravno ili posredno posljedica autoimunih patologija. Na primjer, muška neplodnost može biti uzrokovana autoimunim odgovorom protiv sperme, a u patogenezi ženske neplodnosti može igrati ulogu autoimune bolesti štitnjače ili nadbubrežne žlijezde. Biljezi autoimunih patologija su autoantitijela. Za detekciju autoantitijela u serumu (na primjer, antifosfolipidna protutijela, protutijela na yodidperoksidaze ili 21-hidroksilazu) koji se koristi ELISA analiza immunohemilyuminestsentny metode i indirektne imunofluorescencije. U tom slučaju, kao antigenske podlogu pomoću kriostatskim sekcijama tkiva, na kojima je autoimuna reakcija je usmjerena. Za detekciju antitijela sperme u sjemenu i način cervikalni mukus mikroaglutinacije koriste u gumenim čestica obloženih s antitijelima za IgA ili IgG.

druge metode

Za neke hormone, kao što su kateholamina i serotonina, nije lako utvrditi pouzdane metode ispitivanja. Činjenica da su ti materijali imaju vrlo malu molekularnu težinu i na njih je teško dobiti vrlo specifične primarna protutijela, monoklonsko ravan. Slične poteškoće u razvoju metode za ispitivanje imunokemijskom steroidnih hormona i njihove derivate (s obzirom na visoku vjerojatnost poprečnog reakcijom s različitim primarnim antitijelima steroida koji bi antigenu sličnosti). Dakle, za točne kvantitativne analize takvih agenata u posljednjih nekoliko godina više su zaposleni tekućinske kromatografije visokog učinka slijedi masenom spektrometrijom.

Često, endokrinih poremećaja, uključujući poremećaje spolnog sustava, nisu uzrokovane patološkim promjenama razine gonadotropina i spolnih hormona i njihovi receptori mutacija. Za procjenu funkcije receptora primijenjen biološkim testovima in vitro: pacijent uzeo biopsija tkiva koja je meta hormona, biopsije su stavljeni u medij za kulturu doda se u medij i vrednovati odgovor tkiva na hormon hormona. mutacije danas receptora otkriven pomoću određivanja DNA sekvencu nukleotida u odgovarajućim genima. DNK za takve pokuse se obično dobiva iz limfocita pacijenta.