Terapija-efekt geni odgovorni za sintezu proteina aktina i srčane distrofin na razvoj kroničnog zatajenja srca kod pacijenata s infarktom dilatacijske kardiomiopatije miokardai

DDa bismo razumjeli mehanizme razvoja i progresije hronicheskoyserdechnoy kvara (CHF) istraživanje poslednihlet usredotočiti na procjenu doprinosa genetskih čimbenika vrazvitie krvožilni neuspjeh. Perspektivnympodhodom To je zbog činjenice da je genetski rizik je detektiran i proiskhoditprognozirovanie komplikacija bolesti do njihovog klinicheskihproyavleny [1, 2]. Prema tome, trenutačno na molekularnoj patogenezi kardiomiopatije urovnerassmatrivaetsya kao proiskhoditnarushenie u postupku ekspresije gena, naročito mehanizmovpretranslyatsii, prevođenje i posttranslyatsii koji dovodi do izmeneniyufenotipa [2]. Poznato rada identificirati genetski faktorovrazvitiya CHF u bolesnika s dilatirajuće kardiomiopatije (DCM), posebno u ovih bolesnika pokazao je mutacija na različitim uchastkahgenov odgovorne za sintezu proteina i aktin distrofin [3, 4,5, 6].
Nema objavljenih izvješća o mutatsiigena distrofin i aktina u bolesnika s infarktom miokarda, hotyamozhno pretpostavljaju da sličan mutacija je moguća pod vliyaniemstressa i Neurohormonskih mehanizama aktivacije.
U tom smislu, cilj rada je issledovaniegenov aktin i distrofin u bolesnika s idiopatskom dilatacijske kardiomiopatije, UY osobe s infarktom miokarda.

Materijali i metode

U issledovanievklyucheno 130 bolesnika, uključujući i 104 muškaraca i 26 žena, vozrasteot 21 do 88 godina. Pacijenti su podijeljeni u tri skupine: 1. skupinu- macrofocal i bolesnika s akutnim infarkta miokarda, zatajenja srca komplicirano II - IV po FC NYHA, 2. skupine - s infarktom miokardabez kliničkih znakova otkazivanja srca, 3rd sljedećim skupinama pacijenata s idiopatskom dilatirajuće kardiomiopatije CHF II - IV FC. Kontrolyasostavilo grupa od 30 osoba, uključujući 21 muškaraca i žena, 9 vozrasteot 25 do 76 godine (srednja dob 55.5 godina) bez kardiovaskularnih sosudistoypatologii i bez teških kroničnih bolesti.
Klinički i demografske karakteristike. Bolnyhpredstavlena stol
Proučavanje gena aktin i distrofin proizvodilosv Instituta za opću genetiku, laboratorijskog i radiatsionnoygenetiki okoliša Instituta za biologiju ras gena.
tselnayakrov je korišten za dobivanje DNA, uzet u epruveti s EDTA pri konačnoj koncentraciji 50mMili citrat s konačnom koncentracijom od 0,5%. Izolacija DNA provodilis primjenom "DiatomTMDNA Prep 200" kit reagensa (proizvođač "Biokom"). Osnova izolaciju DNA pomoću ove naboralezhit korištenje reagensa za liziranje na DNA guanidintiotsionatomi sorbent „nukleoz”. U prisutnosti visokih koncentracija guanidintiotsionata (4M) DNA adsorbiran na aktivni površini čestica „nukleoz”, a preostale komponente krvi ostaje u mediju, koji se zatim udalyayutsyatsentrifugirovaniem. DNA ispere spirtosolevym pufer zatemsmyvaetsya extragenic sorbent smjesom ionskog izmjenjivača i za postavljanje napryamuyuispolzuetsya lančanom reakcijom polimeraze (PCR) Izolacija DNA iz krvi provedena je u skladu sa skupom instruktsieyispolzovannogo „DiatomTMDNA Prep 200” „” Biokom tvrtke.
Za otkrivanje mutacija u postupku za gen kardioaktinaispolzovali PCR-RFLP PCR proizvoda, pri čemu rezhetsyasootvetstvuyuschey restrikcijskog enzima, prepoznaje točku interesa nukleotidnuyuzamenu. Restrikcijskim enzimom Bcl I restrikcijskog mjesta (-TGATCA-) vyyavlyaetmissens mutaciju G (norma) do A (mutacije) otopljenog u genskoj kardioaktina eksona 5 koji je povezan s idiopatskim dilatirajuće kardiomiopatije. Sintezpraymerov za istraživanje 5. eksona je kardioaktina drži sintisajzer PE Applied Biosystems (USA). Sastav primera: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R5 / -gatctcccactcacaaaag.
PCR amplifikacija je provedena kako slijedi: 950S rezhimeamplifikatsii - 40, 580S - 30, 740S - od 40 do 30 ciklusa.
Veličina umnoženog fragmenta 222 parynukleotidov. Konačne koncentracije PCR reakcijske smjese: 67 mM TRIS pH = HCl c 8,8, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 jedinica. Taq.polimerazy, 200 mM dNTP svaki, 0,5 mM svakog primera istražena 10-20ng DNA, 1,5 mM MgClz₂,Konačni volumen PCR smjesa 30 ml.
Analizirati pojačanje rezultate 10 mklPTsR produkt se nanese na 2% -tnom agaroznom gel elektroforezom u. vgele DNA razvijen s etidij bromidom uz UV svjetlom valne duljine od 32nm. Nakon vizualnih gosta PCR smjesa PCR koncentracija produkta opredelyaliobem potrebna za postavljanje ograničenje reakcije (5 do 10 l PCR smjesa).

Istraživanje gena distrofin

Za distrofin obnaruzheniyamutatsii u gen uporabom PCR metode s sikvensspetsificheskimipraymerami (PCR-SSP), pri čemu se za ispolzuetsyapara klica za PCR, od kojih jedan sadrži jedan ili dva tochechnyezameny. Jedan od supstitucija je zanimljiv tochechnuyunukleotidnuyu zamjena. Princip metode je u tome što temperatura prioptimalnoy žarena primera u odsustvu specifičnih mutacija pojavljuje pojas PCR proizvoda, i u slučaju mutatsiipri iste temperature i žarenje primeri amplifikatsiine reakcija ide. Dva para odabran sikvensspetsificheskih praymerovprednaznacheny otkrivanja missens-mutaciju od A u G na 9. ekzonegena distrofin normalnog slijeda i mutacije sootvetstvennosvyazannaya s X-vezani idiopatske dilatirajuće kardiomiopatije.
Sinteza primera za istraživanja 5. ekzonakardioaktina je provedeno na sintesajzer PE Applied Biosystems (SAD).
Pripravak iz klice: Dn 5 gta aat GTT GAC aga cctgtg 5 GAA TCG CCT CTC CAG ATC ACG Dm 5 gta aat GTT GAC aga cctgtg 5 gga tcc tet CTC GCA gat CGC
PCR amplifikacija je provedena kako slijedi: 950S rezhimeamplifikatsii - 40 s, 30, 560c - 740S - 40 za 35 ciklusa.
Veličina umnoženog fragmenta 160 parnukleotidov. Konačne koncentracije PCR reakcijske smjese: 67 mM TRIS pH = HCl c 8,8- 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 jedinica. Taq polimeraze 200 mM dNTP svaki, 0,5 mM svakog primera istražena 10-20ng DNA, 1,5 mM MgClz₂,Konačni volumen PCR smjesa 30 ml.
Tablica. Klinički i demografske karakteristike pacijenata.

Analizirati rezultatovamplifikatsii 10 ul PCR proizvoda je primijenjena na 2,5% agaroznom gelu gel pokazao elektroforez.DNK s etidij bromidom uz UV svjetla dugo volny320 nm.
Detektirati točku mutacije u issleduemyhprobah snimljeni amplifitsirovannogofragmenta prisustva ili odsustva odgovarajućeg para početnica:
1. Prisutnost PCR fragmenta 160 parova nukleotidovpri pojačanje parom primera za normalnu posledovatelnostiukazyvaet na norme.
2. Odsutnost PCR fragment s 160 parnukleotidov amplifikacije primera za par normalnoyposledovatelnosti ukazuje na prisustvo mutacije namjeravani.
3. Prisutnost PCR fragmenta od 160 parova nukleotidovpri amplifikacijski prajmer za par sekvenci mutatsieypodtverzhdaet s mutacijom.

Rezultati i rasprava

Kao što je spomenuto, u literaturi nema izvješća o mutaciji gena iaktina distrofin u bolesnika s koronarnom bolesti srca, osobito sinfarktom infarkta, iako pod utjecajem neurohormona i drugih biologicheskiaktivnyh tvari, koje se aktiviraju kao odgovor na povrezhdenieserdechnoy mišića (u ovom slučaju, infarkt miokarda), vozmozhnopredpolozhit slična mutacija. Međutim, unatoč uvjetima pravilnyeteoreticheskie i našim očekivanjima, pronađeni su mutacije gena pacijenata studirao. Osim toga, ne opredelyalasmutatsiya te u bolesnika s dilatacijske kardiomiopatije, iako je u posljednjih nekoliko godina u istraživanja rezultateryada dobiti dovoljno značajne rezultate, zbog genske mutacije kotoryekasayutsya distrofin i aktin sa srcem nedostatochnostyu.V naročito R. Ortiz-Lopez i sur. [2] 3 istraživali genomnuyuDNK nepovezanih obitelji s X-vezani dilatirajuće kardiomiopatije.Kontrolna skupina sastojala od 50 ženskih osoba i 50 muških neyavlyayuschihsya rođaka. Za pojačanje DNA korištena PTSR.V rezultat istraživanja u jednom od obitelji s X-vezani DKMPbyla identificirani genske mutacije kodira distrofin lokalizuyuschegosyav kromosoma 21, a osobito je pronašao zamjenu adenin guaninv eksona 9 na poziciji 1043, što je dovelo do sinteze hidrofobne nepolyarnoyaminokisloty alanin umjesto hidrofilne, polarne treonina koja se nalazi u položaju u distrofin 279, s obzirom KN-terminus proteina distrofin. Zamjena treonina od alanina izmeneniyupolyarnosti vodi na N-kraju proteina i stoga promjena u vtorichnoyi distrofin tercijarnoj strukturi. Tako, ovaj mutatsiyayavlyaetsya izazvati gubitak funkcije stabiliziranja membranskih etogobelka poremećaja i funkcionalnu aktivnost kardiomiocitima, chtoi vodi X-vezani degenerativnih bolesti miokarda- X-vezani dilatacijska kardiomiopatija.
F. Muntoni et al. [4] i Milasini J. et al. [5] opisani su mutacije u drugim mjestima distrofina.Eti dijelovi gena su ispitani R. Ortiz-Lopes i sur. [3] tehzhe 3 obitelji s X-vezani dilatirajuće kardiomiopatije, mutacije u tim mjestima su vyyavlenone. Prema tome, možemo razmišljati o raznim mehanizmima veduschihk distrofinopaties razvoja.
Tako, svaka mutacija distrofinaprivodit do nedostatka miokarda proteina koji yavlyaetsyaprichinoy odsutnost miokarda distrofinassotsiirovannyh glikoproteina [7, 8] koje su odgovorne za vezanje kompleksa multiproteinnogo sbelkami izvanstanični matriks. Rezultat toga yavlyaetsyadezorganizatsiya kardiomiocitima, što dovodi do promjena u mehanicheskoymodeli miokarda, poremećaja njegove crpne funkcije i zatajenje srca.
Što se tiče mutacije srčanog aktin, druže 1998. objavio rad T. Olson i sur. [6] pokazano studijama dva nepovezana semeys autosomno dominantno idiopatska kardiomiopatija (jedan semyanemetskogo porijekla, a drugi - švedska-Norveška). Za vsehchlenov provodi ehokardiografiju, biopsiyamiokarda, DCM identificirati karakteristična svojstva (fokalna interstitsialnyyfibroz i cardiomyocyte hipertrofija). Za otkrivanje mutacije gena za aktin PCR je korištena. dva jedan gen mutatsiietogo identificirani: jednu - u kardioaktina gena 5. eksona (zamjena guaninana adenin, što dovodi do kodira sintezu histidin u 312 mpolozhenii umjesto arginina), a s druge strane - u 6 eksona (zamjenjuje adeninana gvanin, čime se pojavili sintezu 361 položaju glutamin glitsinavmesto). No, mogao te promjene se smatrati vramkah kardioaktina polimorfizma gena. Kako bi se isključila takva predpolozheniyaprotestirovany 435 nepovezanih ljudi opisan mutaciju nije ih vyyavlenou. Dakle, ti oblici assotsiiruyutsyaimenno aktin s idiopatskim prvobitno kardiomiopatija.
Činjenica da naš rad ne bi mogao biti otkriven mutatsiyagenov aktin i distrofin nije izravna tvrdnja da ta mutacija nije. Možda je mutacija javlja vbolee kasnijim fazama bolesti? Treba napomenuti da je u nashemissledovanii ne provodi genetičke analize u obitelji s idiopaticheskoyDKMP i nepovezane osobe odvedene. Vjerojatno glubokihvyvodov također trebaju veliku populaciju u smislu issledovanie.I ne može biti manja smislene studija geni drugihstrukturnyh komponente srčanog mišića, posebno kollagenai elastina mutacije koje također može imati vrijednost u razvitiiHSN.

reference:
1. Tereschenko SN Clinicopathogenetic genetski aspekti kroničnog zatajenja srca ivozmozhnosti korekcije droge. / Disertacija. ... Dr. med. nauk.- M. 1998- 287.
2. Bristow M.R. Zašto je srčani mišić ne uspije? Spoznaje iz bazičnih znanosti. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R. Li H., J. Su, Goytia V. Towbin J.A. Dokazi za distrofin missensemutation kao uzrok X-vezani dilatirajuće kardiomiopatije. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F., M. Cau, Ganau A., R. Congiu, Arvedi G., A. Mateddu, Marrosu M.G., Cianchetti C Realdi G., Cao A., Melis M.A. Kratki izvještaj: brisanje distrofin mišića promoterregion povezana s X-vezani dilatirajuće kardiomiopatije. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasin J. F. Muntoni, Severinija GM BartoloniL., Vatta M., Kraoinovic M., A. Mateddu, Angelini C CameriniF., Falaschi A., Mestroni L., Giacca M. HMD Study Group , Apoint mutacije u 5` nadovezivanje gena distrofin firstintron odgovoran za X-vezana proširene cardiomyopathy.// Hum.Mol. Genet. 1996. 5: 73-9.
6. Olson T.M. Michels V.V., Thibodeau S.N., Tai Y.S., Keating M.T. Aktin mutacije u dilatacijske kardiomiopatije, nasljedna oblik zatajenja srca. // Znanost. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R.D., Maeda M, Roberds S.L., HolderE., Bohlmeyer T., J. B. Young, Campbell K.P. 5` distrofin duplicationmutation uzrokuje nedostatak alfa-membrane u dystroglycan afamily s X-vezani kardiomiopatije. // Mol. Stanica. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W.M., Cremer M., R. Herrmann, GrunigE., W. Fogel, Scheffold T., Goebel H.H., Kircheisen R., KublerW., Voit T. et al. X-vezani dilatacijska kardiomiopatija. Novi mutationof gena distrofin. // Ann, NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.