Transgenske životinje: tehnologija

Video: Bioseminars.ru: Egor Malashichev - transgenske životinje i komparativna embriologija

Za razliku od biljaka, pri čemu postoji mogućnost dobivanja plodno biljku iz transformirane somatskih stanica i kloniranje, proizvodnja transgenih životinja - vrlo težak i dugotrajan proces.

Strategija koristi je kako slijedi:
1. Klonirani gen uveden u oplođenog jajašca jezgre.
2. oplođenog jajašca s egzogene DNA implantirani u žena primatelja (od uspješnog završetka embrija sisavaca u drugim okolnostima nemogućom).
3. margina potomci razvijen od implantiranih jajnih stanica koje sadrže kloniranog gena u svim stanicama.
4. izvitopereni životinje koje nose kloniranog gena u stanicama zametne linije ili dati novu genetsku liniju.

Pokusi na genetski modificiranih višestaničnih organizama uvođenjem transgena u njih zahtijevaju puno vremena. Međutim, transgenični postaje snažan alat za proučavanje molekularnih temelja ekspresije sisavca gena i razvoja, stvaranje modela sustava, čime studija ljudskih bolesti, kao i genetsku modifikaciju mliječne žlijezde životinjskih stanica za proizvodnju mliječne bjelančevine važne za lijek. Bilo je još novi pojam „pharming» (pharming), koji se odnosi na postupak pripreme mlijeku transgenskih životinja autentične ljudske proteine ili farmaceutike.

Korištenje mlijeko je svrhovito, jer se stvara u tijelu životinje u velikom broju i može nadaivat po potrebi bez štete životinju. Proizvedena mliječnoj žlijezdi i izlučuje u mlijeko nije novi protein mora stoga pokazuju nikakve štetne učinke na normalnim fiziološkim procesima kod transgenskih životinja, i podvrgnut post-translacijske promjene koje, barem u blizini one u ljudskim stanicama. Osim toga, njegova izolacija od mlijeka, koje sadrži i druge proteine, ne smije biti previše teško.

Unatoč činjenici da je prvi mutirana životinja dobivene su 1985. godine uvođenje egzogenim DNA u pronuclear zigota još nije razvila učinkovita metoda koja se može koristiti za stvaranje genetski modificirane životinje, bez obzira na vrstu i namjenu pokusa. Razvoj novih učinkovitih metoda prijenosa gena u embrionalnih i somatskih stanica životinja, kao i poboljšanje postojećih pristupa je hitna zadaća.

Među velikim različite načine uvođenja egzogene DNA u životinja genoma mogu se razlikovati, koje se naširoko koriste u praksi ti'ansgeničmh:
- Postupak mikroinjekcijom,
- retrovirus posredovanih prijenos gena,
- modifitsirovanngh upotrebu embrionalnih matičnih stanica,
- prijenos jezgara transformirane generativne i somatskih stanica
- upotreba spermatozoida i spermatogonija kao vektora DNA.

Među ostalim postupcima dostave egzogene DNA u organizam životinja može napomenuti upotrebu liposoma, vektore adenovirusa, kao i metoda za ubrizgavanje velike brzine. Međutim, ove metode nisu naširoko koristi zbog njihove nedovoljne stabilnosti i nedostatak integracije transgena u genomu.

Mikroinjekcija rekombinantne DNA u oplođene jajne stanice višestaničnih životinja su još uvijek najpopularniji način za uvođenje stranih gena u životinje. Unatoč činjenici da je ova metoda zahtijeva visoku vještinu i skupe opreme, jednostavnost i pouzdanost su plaćati sve svoje nedostatke.

Prvi i najveći dobro uspostavljen eksperimentalni sustav za proizvodnju transgenih životinja je miš. Donor ženke s eksperimentalnim superovuliranja sparen s mužjaka proizvodnje, nakon 12 sati se izolira oplođena jaja i stavljen u kulturi. Nadalje, to je veća od dva (pronukleus obično muškim) bili su injektirani pomoću rekombinantne DNA (Sl. 2.17). Preživjeli ubrizgana jaje transplantiraju u žena primatelja. Samo dio transplantiranih jajne stanice i dalje razvijati do teljenja.

Sl. 2.17. Mikroinjektiranje egzogene DNA u pronukleus oplođenog jajašca sisavca pod mikroskopom (a) i postavci eksperimenta (B)

Učestalost integracije egzogene DNA pomoću mikroinjekcijskom metodom pod utjecajem takvih faktora kao što čistoćom ubrizgavanja uzorka, oblik i koncentracije DNA, sastav puferske otopine za mikroinjekcije, kvalitetu embrija, i postupak prijenosa embrija primatelja (nonsurgical, kirurški, laparoskopske).

Transgenične životinje su identificirani u potomaka raznih postupaka, većina PCR i uparen da se dobije transgenih linija. Neke od transgeničnih životinja su mozaik (zametne stanice ne sadrži egzogenu DNA) križanjem transgeničnih stoga je manji dio prve generacije potomstvo od izračunatog 50%. U nekim slučajevima, homozigotni linije ne mogu dobiti zbog genetski promijenjenim umecima 5-15% homozigota smrtonosan, kao što je umetanje ponekad krši vitalne dijelove genoma.

Točan mehanizam za integraciju ubrizganog DNK u kromosomima ciljnih stanica nije poznat, ali analiza umetnute DNA strukture otkriva određene točke. Integracija događa slučajno na jednom kromosomskom lokusu, koji može sadržavati jedan do nekoliko tisuća tandem primjeraka integriranog DNK. Oko 30% primarnih transgeničnih životinja dobivenih obično pokazuju određeni stupanj mozaik koji mogu nastati integracije egzogene DNA replikacije nakon prvog ciklusa.

Stupanj integracije egzogene DNA u genom, tj broj transgenih životinja od ukupnog broja rođen životinja korištenjem metode mikorinjektiranje, ovisno o vrsti varira u malom rasponu od 5-15%. Najvažniji s obzirom na trošak potreban za proizvodnju jedne transgenih životinja je transgena ukupni indeks učinkovitosti, koji se izračunava kao omjer dobivenog transgenične životinje od ukupnog broja transplantiranih embrija, izražen kao postotak. Vrijednost ovog indeksa sisavaca je relativno konstantna na prosječno ~ 0,5% za svinje i krava do oko 2% u miševima.

Retrovirusni vektori također se koriste za proizvodnju transgenih životinja. Infekcija predimplantacijsku embrija s rekombinantni retrovirusi - relativno jednostavan djelotvoran postupak.

Vosmikletochnuyu morula (Sl. 2.18) oslobođen iz ljuske jajeta i stavljena u posudice za kulturu s fibroblastima proizvodnju rekombinantnog retrovirusa. Zaražene embriji postignut blastula pozornici su bili implantirani u pseudogravidne ženki. Kao rezultat, transgenske organizmi generiraju, mozaika prema broju i lokacijama izgrađen-ins rekombinantne DNA u genom. Stoga, da bi se dobila čista linija dodatno zahtijeva velikih outbreeding.

Nedostatak te metode je da se ograniči umetanje egzogenih DNA-8 potrošnju, pri čemu se transgen može biti bez susjednih regulatorne sekvence potrebne za ekspresiju, te u nekim slučajevima, integrirati u izvornom lokus nestabilne.

Novi lentivirasni vektori (lentivirusi pripadaju obitelji retrovirusa) su pokazali svoju vrlo visoku učinkovitost u isporuci DNK u jajnih stanica i zigota. Injektiranje rekombinantne lentivirusni konstrukta u prostoru perivitelline svinja i goveda zigota oocita rezultirala pojavom potomstva s najvišim trenutno režnjeva transgeničnih životinja. U isto vrijeme, lentivirasni vektori imaju sve nedostatke retrovirusnih: male veličine umetanje egzogene DNA i višestruke integracije u genom domaćina, što može dovesti do neželjenih nuspojava kao što su aktivacija onkogena i insertne mutageneze. Nadalje, lentivirusne vektore za visoki stupanj mozaika transgenske potomaka proizvedene i pojedinačne činjenice stišavanje buke (deaktiviranja) rekombinantni lentivirusne sljedovi dobiveni transgenih linija.

Korištenje retrovirusnih vektora ima jedan veliki nedostatak. Iako su ti vektori stvoren tako da su replikacija-defektni retrovirus soj Genom (pomagač virus) koja je potrebna za dobivanje velike količine vektora DNA može pasti u istu jezgru kao transgena. Unatoč svim poduzetim mjerama, retrovirusi pomagači može replicirati u transgenične životinje, što je apsolutno neprihvatljivo, ako te životinje koja se koristi kao hrana ili kao sredstvo za dobivanje komercijalni proizvod. A budući da postoje alternativne metode transgeneza, retrovirusa vektori se rijetko koriste za generiranje transgeničnih životinja koje imaju komercijalnu vrijednost.

Sl. 2.18. Shema za dobivanje linije transgeničnih miševa pomoću retrovirusnih vektora

Modificirani embrionske matične stanice mogu se koristiti za dobivanje transgenične životinje. Stanice izolirane iz mišjih embrija na blastociste fazi, može proliferiraju u kulturi, a zadržava sposobnost da se diferenciraju u bilo koje vrste stanica, uključujući stanice linije klica, kada se primjenjuje na drugi embrija u stadiju blastociste (Sl. 2.19).

Takve stanice se zove pluripotentne matične stanice embrija (ES). ES-stanice u kulturi može uvesti transgen ciljne različite tehnike (transfekcijom, elektroporacijom, retrovirusne infekcije, i sl), bez opasnosti po njihovu pluripotency. Praktična prednost ovog programa je da daje veliku priliku za odabir stanica za određeni parametar. To može biti broj kopija transgena, njegove lokalizacije ili ekspresije uzoraka.

Znajući slijed okolne određenu mjesto za željenu integraciju, možete konstruirati vektor za umetanje ciljne DNA homologne rekombinacije. Na primjer, zamijeniti gen kodira indikaciju radi selekcije odredivo uklanjanjem njegove ili obnavljanje funkcije u dobivenom transgenska stanica.

Na isti način, tzv nokaut miševa (knock out) - miševa s inaktiviranim genom usmjereno specifičnom staničnom proučavati svoju funkciju. Provesti do homologne rekombinacije vektor konstruiran od fragmenata ciljani gen, koji je predviđen za inaktivaciju dio ciljnog gena se zatim zamijenjena selektabilni marker za odabir stanica s integriranim dizajn.

Sl. 2.19. Priprava transgeničnih miševa rekonstrukcijom embrija upotrebom genetski modificirana embrionalnih matičnih stanica (ES-stanice). ES-stanice su dobivene iz stanične mase unutarnje od mišjeg blastociste

Odabrane transgenične ES-stanice se mogu uzgajati i upotrebljava se za proizvodnju transgenih životinja. To sprečava slučajno umetanje transgena, što je karakteristično za metodu i mikroinjiciranja retrovirusnih vektorskih sustava.

Svi primljeni u okviru programa mozaika životinje su toliko potrebno za uzgoj rad za dobivanje čiste linije. Primarni problem mozaik genetski promijenjene životinje može prevladati transplantacije jezgre pretvaraju ES-stanice u izvađene jajne stanice koje su potom nastavili svoj normalan razvoj. Kao rezultat toga, u svakoj stanici životinje dobivene će sadržavati transgena.

Nažalost, pluripotentne ES-stanice, slično miša dok se u drugih sisavaca i ptica, ali potraga se nastavlja.

Nuklearni transfer transformirane generativnih i somatskih stanica u jajetu, ili somatske nuklearni transfer (somatske prijenos nuklearne), druga metoda koja se koristi u praksi transgeneza. Pokazalo se da je jezgra stanice embrionalnog raznih životinja kada se prenosi na izvađene jaje ponekad u mogućnosti osigurati razvoj novog organizma. Nakon kratkog uzgoja i jezgra neke od diferenciranih stanica su u stanju osigurati razvoj održivog pojedinca.

Na primjer, poznati Dolly ovce kloniran 1997. spajanja uzgajanih (3-6 prolaza) dojke epitelnih stanica (vimena) kod odraslih životinja sa šest godinu dana bez jezgre jajašce (Sl. 2.20). Iako ne možemo isključiti mogućnost da je kloniranje je slučajno uzeo nediferencirane stanice prisutne u donatora epitela.

Sl. 2.20. Kloniranje ovaca nuklearnim transferom. epitelnih stanica dojke u kulturi se inducira ući u fazi G0 (faza u kojoj jaje). Zatim, fuzija tih stanica s izvađenom jezgrom jajne stanice i embriji se uzgaja u ranim fazama embriogeneze. Nakon što su embriji ugrađuju u maternicu surogat majke, gdje je daljnji razvoj odvija. U eksperimentu, J. Wilmut (I. Wilmut) Kloniranje je izvedeno kolica 277 m izvađene jajne stanice sa stanica dojke u fazi G0 od 29 embrija preživjelih razvijena samo na jednu održiv organizam

Valjak Kloniranje jezgri stanica diferenciran, a druga tri od embrionalnih ovaca jezgri stanice mogu implementirati prijenosom jezgre iz stanice koje su u fazi mirovanja (G0), a možda i karakteristike životinja embriogeneze. U ovaca zigota unutar prva tri odjela, zauzimaju nekoliko dana, samo da se događa replikacija DNA, nitko od gena nije izražena. Pretpostavlja se da je za to vrijeme uveo DNA se oslobađa iz stanica specifičnih regulatornih proteina i odgovarajuće gene povezane s embrionalnom razvoju embrija inicijator proteina faktora iz citoplazme jajne stanice.

Dok kloniranje tehnologije su još uvijek jako daleko od savršenstva - klonirana Dolly otkriva mnoge znakove prijevremenog starenja, što je vrlo obećavajuće tehnologije za proizvodnju transgenih životinja. Čak i ako postoje razni problemi sa prve generacije, najvjerojatnije, druga generacija neće imati nedostatke, stečena kroz korištenje „stare” za jezgre jaja.

Glavni problem koji treba riješiti kako bi se stvorili bilo transgenih životinja pomoću metode nuklearni transfer bio pravi, - je očuvanje pluripotentne stanice kontinuirano u kulturi. Trenutno se aktivno traži faktori reprogramiranje diferencirane stanice da izazove pluripotency. Ako to uspije, genetska modifikacija tih stanica i stvaranje genetski promijenjenim organizmima somatske nuklearnim transferom će postati gotovo rutinski postupak, a dok su izolirani uspješni eksperimenti.

Umjetnim kromosomima kao transgenskog vektor. Većina transgena su cDNA mali geni (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы.

S obzirom na sve to, uporaba čelika za transgenih gljivičnog umjetnog kromosoma (YAC), zatvaraju fragmenata genomske DNA dužine od 100 do > 1000 potrošačke robe i umjetnih kromosoma još veći kapacitet (oko umjetnih kromosoma). Te episomalni vektori imaju još jednu prednost, - izbjeći efekt na ekspresiju gena položaju kada je egzogena DNA. Razina ekspresije umetnutog gena vrlo je ovisna o svom položaju kromosomskih, na primjer, ugradnja neaktivni kromatina (heterokromatin) netaknute kromosom dovodi do inaktivacije gena.

Koristeći umjetni kromosom kvasca (YAC), koji nosi više srodnih gena ili velikih gen, transgenski miševi su generirani pomoću mikroinjekcije u pronukleus oplođenog jajašca ili transfekcijom ES-stanica. Transgenični miševi koji nose skupine od pet funkcionalnih humanih bina genovv ukupnoj dužini od oko 250 robe široke potrošnje, a sve od tih gena izraženi tkiva posebno i u pravo vrijeme upravo na isti način kao što to radi i kod ljudi. Takva usklađenost je osigurana njihova bočne sekvence koje sadrže promotor i ostale regulatorne elemente važne. YAC-koriste transgenični miševi koji su dobiveni sintetizirani samo ljudska antitijela su tetramerna složena struktura dva para različita polipeptidna lanca.

Ljudski umjetnih kromosoma (humani umjetni kromosom -HAC), koji sadrži cijeli lokusa humanog imunoglobulina s teških i lakih lanaca su uvedeni u goveda fibroblasta, koje se zatim koriste za prijenos jezgre somatskog. Primljeni transkhromosomalnye telad izraze ljudskog imunoglobulina u krvi. Ovaj sustav je važan korak u smjeru životinja proizvodnju terapeutskih humanih poliklonalnih antitijela.

Daljnje promatranje transgenim životinjama pokazala su da su rekombinantni HACs održava u većini prve generacije ljudi tijekom nekoliko godina. Hoće li ili nisu primili umjetnih kromosoma pravilno odvajaju vrijeme mejoze i naslijedio, ostaje da se vidi.

U novije vrijeme, novi obećavajuće tehnologije za životinje s genima invaliditetom - mali ometa RNA (siRNA, siRNK), koji se koriste za isključivanje ciljem gene (utišavanje). RNA interferencije - konzervativna post-transkripcijski regulatorni proces. Dvolančana mala interferirajuća siRNA na 19-23 nukleotida specifično vežu za njegovu komplementarnu sekvencu predloška ciljne mRNA, usmjeravajući uz razgradnju put.

RNA interferencija je dio sustava regulacije gena, a to smanjuje kontrola / translaciju mRNA od endogenih i egzogenih virusne elemente i mogu se koristiti u terapijske svrhe. Za prijelazne gen isključivanja sintetski siRNK su preseli u stanice ili početkom embrija. Stabilno gena potiskivanja siRNA sekvenca bi trebala biti uključeni u genom kao dio ekspresije gena konstrukta.

Vrlo učinkovita kombinacija lentiviralnih vektora s siRNA za integraciju u genomu. Za razliku od klasičnog knock-out strategija koja zahtijeva dugo uzgojne linije za dobivanje čistog inaktivirani gen u oba lokusa diploidne genoma siRNK Integracija lako može isključiti ciljani gen u bilo životinja na raspolaganju liniju.

Unatoč raznolikim tehnikama razvijenim za proizvodnju transgenih životinja, do sada nije pouzdana i učinkovita tehnologija za transgenih životinja. Najveći problemi vezani su za umetanje slučajnih egzogene DNA u genom sa većinom postojećih metoda. Tako da i dalje kvaliteta tehnologija poboljšanja potrebno je razviti opažanje izmjenom stanične gene i precizno ubacivanje egzogene DNA u genomu.

Što više da većina genoma gospodarski važnih organizama do sada potpuno izolirani i može planirati buduću strukturu transgenske organizma. Kombinacija u potpunosti dekodirane genomskih sekvencija s postupcima ciljanu isporuku egzogene DNA omogućuje konstrukciju transgenih ciljanih genoma s unaprijed određenim osobinama.

NA Ratnika, TG Volova

Dijelite na društvenim mrežama:

Povezan