Metode za laboratorijske dijagnostike klamidijske infekcije u maksilarnom sinusitis

Video: Otorinolaringolog Ponidelko SN (SM Clinic)

I. Tsitoskopichesky Postupak detekcije klamidije

To je predložio dvije metode koje se mogu podijeliti u invazivni i neinvazivni. SAŽETAK Prvi je da je materijal za proučavanje je sadržaj gornjih sinusa, što je rezultiralo s iglama Kulikovskii probijanje koji je nakon centrifugiranja se koristi za pripremu mrlje.

Druga metoda je kako slijedi: nakon nazalni anemizatsii 0,1% otopine epinefrin i primjene anestezije središnji dio nazalni prolaz dikaina 3% otopinom - 0,3 ml, pomoću posebnih jednokratnu četke nose ograda materijal u rotirajućim pokretima između 10-15 medijalne površine srednjeg školjke i bočnog zida nazalnog u području paranazalnih sinusa anastomoze. Tako dobiveni materijal se ravnomjerno na staklenu ploču, osušen na zraku i fiskirane u acetonu 10 minuta pri 4-6 ° C Gotova brisevi mogu se pohraniti do studija za 2 tjedna. na temperaturi od 2-6 ° C

Slikanje na Romanovsky-Giemsa. Ex tempore boja razrijedi s destiliranom vodom 1:10. Rezovi su smješteni u Petrijevoj zdjelici na drvenim palicama droga dolje. Prostor između moždanog udara i na dnu čaše je ispunjen bojom. Bojanje se vrši 45 minuta. Zatim stakla temeljito ispere pod tekućom vodom, osuši s filter papir i diferencirati u zakiseli alkoholu (100 ml 96% etanola se doda 10 kapi ledene octene kiseline). Nakon bojanja pripravaka gledano u svjetlosnim mikroskopom korištenjem zaštitno leće (X90). U ovom slučaju, stanica citoplazma obojeni plavo, jezgre - u ljubičastom plavom citoplazmatski uklju klamidija se određuje kao tamno plave ili ružičaste mikrokolonija na pozadini plavog citoplazmi. U stupnju elementarne tijela Chlamydia inkluzije su obojeni ružičasti korak inicijalnih stanica u plavoj boji (Ponidelko SN, 2001). Kako bi se povećala informacijski sadržaj ove metode morfoloških istraživanja provedenih u prebrojavanjem broja neutrofila, limfocita i makrofaga u razmazima pripremljenim prije liječenja i dinamike pod utjecajem droga uzima.

II. Postupak izravnog imunofluorescencije

Razmazom pripremljenim s soskobnyh materijala, kao i krv Razmazi obojene s mješavinom uzeti u radnim razrjeđenjima polivalentni imunoglobulina fluorescentni klamidije i goveđeg albumina, označenih s rodaminom za kontrastnim pozadinu. Upotrijebiti radno razrjeđenje seruma 1 / 20-1 / 40. Stakalca s testiranog materijala i postavljeni boja se stavi u vlažnoj komori u termostatu na 30 minuta, nakon čega se staklo se odstrani i obilno ispiru u fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom (pH 7.2) na magnetskom miješalicom 1 sat, promjenom pufera, nakon 30 minuta. Osušenih mrlja primjenjuje jedna kap puferirana glicerola (9 ml glicerola i 1 ml fosfatno puferiranoj otopini soli), a zatim su pokriveni s pokrovnim staklom (Ponidelko SN, 2001). Pripreme pregledavanja pod fluorescentnim mikroskopom „LUMAM-OUT”. Profitabilnost Analiza se provodi vizualno. Rezultati se smatraju pozitivnim, ako je u pripremi otkriven morfološki tipične klamidija elemente specifične za fluorescentne smaragdno-zelene ili žuto-zelena:

Klamidija mrežaste stanice (PT) i klamidija clustera u citoplazmi u obliku mikrokolonija, koji imaju oblik kompaktnih, difuzno obojene formacije različitih veličina - od 0.25 do 1.5 mikrona;
Chlamydia elementarne tijela (EBS) - stvaranje što su uglavnom izvan stanica, sferni oblik ili ima izrazitu jajolik obojenog kružnog ruba u obliku zatvorenog prstena ili semiring veličine 0.25-0.5 mm;
intercellularly nalazi uključivanje - velike svijetlo zelene boje, mrlje nastale su blizu jedna drugoj ET.

III. serološke metode

volumen krvi u 2,5-3,0 ml u natašte predmeta uzetih iz kubitalnom vene u suhom epruvete za centrifugiranje. Cijev krvi kako bi se bolje ugruška uvlačenje tjelešaca inkubira na 37 ° C za 40-45 min. Nakon inkubacije tuba je centrifugirana 20 min pri 3000 okr /. Min ugrušak „zaokružiti”, a cijev se stavi 1 sat u hladnjak, a zatim, pomoću Pasteurove pipete je serum odvojen od taloga. Serumi su preneseni u laboratorij u sljedećih 1.5-2 sata ili spremljenog na 4-6 ° C tijekom 1-3 dana. Pojedinačne uzorke seruma sadrži dopušteno u zamrzivaču u hladnjaku na temperaturi od minus 20 do 40 ° C do serijske studija tijekom razdoblja koje ne prelazi 6 mjeseci.

Najviše specifičan i informativan (90%) smatra da je reakcija indirektne imunofluorescencije (RNIF). Detekcija antitijela klamidija samo jedan uzorak seruma i kada njihova učinkovitost titar od 1 / 8-1 / 16 može navesti vjerojatnost struje kao klamidijske infekcije i prisustvo tragova reakcije povezane s bilo klamidijske bolesti etiologije migrirale posljednji. Povećanje klamidijske titra protutijela 1 / 64-1 / 256, pa čak i više u jednom uzorku seruma na sadašnjoj duge i komplicirane oblike zaraze odražava nakupljanje ograničiti mikroorganizam humoralni odgovor i odgovarajuće rezultate kliničke i epidemiološke analize i anamnestičke podatke usvajajući dijagnostičku vrijednost.

Indirektna imunofluorescencija tehnika omogućuje identifikaciju klamidija oblikovati s odgovarajućim ispitnim predmetima i titracije seruma s obzirom na određene vrste agenata, i čini moguće ocijeniti sadržaj serumu pojedinih klasa imunoglobulina u prisutnosti komercijalne fluorescentne Ig M, A, G, negativni rezultati seroloških testova ne isključuje prisutnost akutne ili kronične perzistentne () klamidijske infekcije (Ponidelko SN, 2001).

Koristeći RNIF maksilarni sinusitis bolesnika odrediti titar antitijela Chlamydia u serumu. Kao što se antigene pripravci se pripremaju na mrlje obrubljenim tobogana mikrobne suspenzije, fiksni 30 minuta s hladnim acetonom. Materijal za razmazivanja suspenzije su mješavina jajeta vrećica pilećih embrija ili organima miševa inficiranih s bijelim C. trachomatis, C. pneumoniae i C. psittaci.

Ove antigene pripravci, koji ima specifičnost za razine roda, osigurati identifikaciju Chlamydia antitijela (AT) epidemiološki značajne za sve vrste klamidija. Test serum, u razrjeđenju od 1: 2 do 1: 256 nanosi na obuću, staklo, nalazi se u vlažnoj komori i inkubira na 37 ° C 15-20 min. Nakon izlaganja test tvar se ispire s vodom, a zatim je staklo je uronjena u šalici baterije s fosfat-puferiranom fiziološkom otopinom, pH 7,2-7,4, a zatim se ispere s destiliranom vodom. Nakon sušenja na sobnoj temperaturi, da uzrokuje mrlje snimljene na radnom razrjeđenju zečjeg anti-humanog imunoglobulina i svjetlećim stavljanje staklo vlažnoj komori, inkubirana na 37 ° C 15-20 min. Zatim bojanje smjesa je uklonjena, staklo se ispere fosfatno puferiranom fiziološkom pH 7.2-7.4 10 minuta, ispere s destiliranom vodom i osuše na zraku.

Mikroskopija obojenog pripravaka provedeno je pomoću fluorescencijskog mikroskopa. Intenzitet fluorescencije na specifične formulacije je procijenjen konvencionalnom chetyrehkrestovoy skali (Ponidelko SN, 2001):

„++++” - svijetle fluorescentne smaragdno zelene oko EBS jasno vidljiv svjetlećih „felge”;

„+++” - svijetle dovoljno fluorescentna žuto-zelene boje, periferna „felge” u ET može biti otkriven;

„++” - slaba fluorescencija, patogen morfološki vrlo jasno pokazala, ali perifernim „felge” u ET jedva vidljivog;

„+” - slaba fluorescencija, boja nedefinirani morfologije mikroskopija objekt vidljiv loše.

Za dijagnostički-značajan titar anti-klamidija antitijela uzeti maksimalnu razrjeđenju seruma koji daje specifično bojanje ne manje od „++”. Pri vrednovanju sera serološkim djelovanje protiv klamidijske antigena za primanje dijagnostički značajne titre od 1: 8 i više.

IV. Postupak lančane reakcije polimeraze

Lančana reakcija polimeraze (PCR) je prvi put opisana u 1985 i postao standardni postupak za umnožavanje DNA u mnogim laboratorijima molekularne biologije. Osnova tehnike čine oligonukleotide usmjerene ponavljajuće cikluse sinteze DNA u vodi in vitro replikacija ciljne nukleotidne sekvence. Kao rezultat, može doći do amplifikacije 1 milijarde kopija ciljne DNA, koje se može detektirati ili gel elektroforezom ili hibridizacijom sa specifičnom probom, nakon čega slijedi određivanje hibrida ELISA testom (ELISA). PCR ima visoku vrsnu specifičnost i osjetljivost na 10 molekula DNA (Ponidelko SN, 2001).

Nakon sakupljanja materijala prema gornjim postupcima uporabom posebne četke za jednokratnu upotrebu je smještena u sterilne epruvete, 2 ml (epindorfy) dobije unaprijed u puferu (0,9% otopina natrijevog klorida). Materijal za 2 sata i preneseni u laboratorij nakon smrzavanja do temperature minus 18 ° C je nastavljeno tijekom dugo vremena prije ispitivanja.

Rezultat analize smatra se pozitivnim ako:

veličina DNA produkta u kliničkom uzorku točno odgovara DNA produkta kontrolnom uzorku;
u uzorku koji sadrži klinički uzorak i interni standard, identificira specifičnim DNA produkta unutarnjeg standarda;
u uzorku koji sadrži vodu (negativna kontrola), umjesto kliničkog uzorka, DNA produkt je otkriven.

Rezultat analize smatra negativnim ako:

u uzorku koji sadrži klinički uzorak, specifičnih DNA proizvoda ne može detektirati;
PCR rezultati u oba uzorka za kontrolu specifičnih DNA proizvodi ne otkrivaju.

Analiza je ponoviti ako:

u uzorku, koji obuhvaća kontrolne DNA, DNA proizvode specifične ne može detektirati;
u uzorku s internim standardom specifičan DNA proizvoda, ne mogu se detektirati, a otkriven specifičnog DNA produkta u negativnoj kontroli.

V. Postupak kulture za izolaciju klamidija

Izolacija patogena na staničnim kulturama (cm), prethodno liječenih različitim protu-metabolita, jedan je od najboljih načina za klamidija dijagnoze, takozvani „zlatni standard”.

Materijal je prenesen kao direktna metoda imunofluorescencije (PIF), sterilne specijalne četke. Gledano materijal se nalazi u transportnom mediju. Kao transportni medij je fosfatni pufer sa saharozom, u koju se doda prije upotrebe toplinski inaktiviranog goveđeg seruma na 4% ukupno, streptomicina 50 ug / ml amfotericina B 25 mg / ml medija. Isporuka materijala u laboratoriju provodi (u termos sa ledom) najkasnije dva sata nakon uzorkovanja. Kulture provodi upotrebom stanične kulture LLC + mR2 + L929 + BHK-21C umjetno nizak otpor. Pokupiti materijal je laminiran monoslojevi kulturama stanica, koje rastu na pokrovnim prethodno isušen medija za rast. Zatim je kultura zaražene stanice se stavi u bočice i centrifugira se 1 h pri 3000 okr. / Min, koja se povećava broj intracelularnih inkluzija. Nakon centrifugiranja, materijal se sipa u bočice, dodati izolacijski medij „igle» (MEM), sa Eaglas tsiklogeksamidom u koncentraciji od 2 mg / ml. Epruvete su inkubirane u termostatu na 37 ° C tijekom 48-72 sata (odgovara vrijeme ciklusa klamidija), nakon čega su stakalca su uklonjeni iz monosloj sa cijevi, postavljene na stakalca se monosloj u kanadskoj balzama i određivanje inkluzijski patogen. Prije toga, fiksacija i bojenje obavlja mrlje flyuorestsiiruyuschimi antitijela i rezultati procjenjuje nakon 48-72 sata od strane PIF (koristeći specifične poliklonalna i monoklonalna antitijela). Po primitku negativnih rezultata proizvoditi novi sjeme (prolaz) materijala. Infekcija staničnog i vrednovanja rezultata vrši se standardnim metodama.

Način dijagnostičke dodjelu klamidija u kulturi stanica mora se koristiti tijekom cijelog razdoblja bolesti, osim za vrijeme antibiotske terapije i za 2-3 mjeseci. nakon njega. Za kontrolu lijek kako bi se utvrdili održive klamidija, koje mogu ostvariti svoj puni životni ciklus, ova metoda se koristi, nakon 3 mjeseca. nakon završetka liječenja.

VI. Postupak elektronska mikroskopija

Kako bi se dobio dijagnostičke trajnu klamidije infekcije u maksilarnom postupku sinusitis pomoću elektronskog mikroskopa. Studija biopsija materijala sluznice nosa i sinusa. Za ovu svrhu, sluznice dijelova odmah nakon ograde su fiksirane u 2.5% glutaraldehidu th 0,1 molarni kakodilatu puferu pri pH 7,4 2-24 sati. Nakon ispiranja tri puta u puferu kakodilatu dofiksiruyutsya 1% otopina osmij tetroksida za 1.5-2 h. dehidracija se provodi u alkoholima rastućim koncentracijama lijeka za 15-20 minuta i smole za impregniranje u smjesi s najvjerojatnije u lokalnoj radionici aralditom. U zaključku, polimerizacija se provodi u inkubatoru 3 dana. na 37 ° C i 60 ° C Nakon polimerizacije su semithin dijelova dobije se 1 mikrona debeli na ultratome LKB-3 (Švedska). Obojene kriške se izvodi u skladu s postupkom predloženog C. D. Humphrey, F. E. Pittman (1974), metilen plavo, plavo-2 i osnovna fuksin za pregled i analizu svjetlosnim mikroskopom (Ponidelko SN, 2001). Istovremeno snimanje fotografija pomoću photomicroscope «Opton» (Njemačka). Zatim pripremiti ultratanku sekcije debljine 3700 angstrema, nalazi se na njihovom bakra veličine oka od 200, a zatim u suprotnosti sa zasićenom otopinom 30% etanola i vode citrat (Reynolds). Rezovi su ispitani pod elektronskim mikroskopom «JEM 100S» (Japan) na ubrzanje naponom od 80 kV, uz povećanje x5, X10, X30, X50 tisuću puta. Foto koristiti filma tipa FT-41p (Rusija).

Za dijagnozu klamidijske lezija paranazalnih sinusa, potrebno je koristiti posebne dijagnostički algoritam.

Osnovni princip dijagnostičke pretrage je njegova tri stupnja.

U prvoj fazi studije skrininga serumu bolesnika sa sinusitis za otkrivanje klamidije antitijela indikativno tijeku infekcije ELISA i RNIF i provjere vrste Chlamydia pneumoniae, (C. C. trachomatis, C.psittaci).

U drugoj fazi preko PIF i PCR se izvodi direktno u dijagnostici klamidijske žarišta (nosnu šupljinu i paranazalnih sinusa) i leukocita periferne krvi utvrditi opću infekcije.

U trećoj fazi dijagnosticiranja pomoću CM odrediti antibiotik sredstava osjetljivosti.

Ovaj algoritam je testiran u anketi od 97 pacijenata, uključujući i one s kroničnim maksilarnog sinusa iznosio 28 ljudi, 39 su bili pacijenti s rekurentnim akutnim maksilarnog sinusa i 30 - ne pate od bolesti gornjih dišnih putova i ušao u kontrolnu skupinu. Usporedni informativnosti različite laboratorijske metode za dijagnostiku klamidijske infekcije među skupinama ispitanika podatke prikazane u tablici.

Usporedni informativnosti različite laboratorijske metode za dijagnozu klamidijske infekcije u sinusitis

način	klamidijska infekcija
način	S. pneumoniae	C. trachomatis	C. psittaci	samo
Uzajamni fond	59 (60,7%)
PCR	35 (36%)	8 (8,2%)	-	43 (44,3%)
KM	31 (31,9%)	11 (11,3%)	-	42 (43,2%)
RNIF	25 (25,7%)	14 (14,4%)	7 (7,2%)	46 (47,3%)

Kao što se vidi iz podataka prikazanih u materijalu od bolesnika s poliklonalnim klamidija skupina specifičnih anti-antitijela Chlamydia dijagnosticiran u 59 (60,7%) bolesnika. Međutim, korištenje drugih dijagnostičkih tehnika omogućila njihovu punu identifikaciju. Kada je podešena približno jednaka frekvenciji detekcije S. pneumoniae i C. trachomatis pacijenata u materijalima sinusitis (PCR - 44,3% CM - 43,2%, RNIF - 40.2%).

Dakle, rezultati komparativne studije metoda za dijagnostiku klamidijske infekcije pokazala je visoku učestalost otkrivanja klamidije s maksilarnog sinusa koja omogućuje definiciju „klamidija etiologije sinusitis” i identificirati niz kliničkih obilježja, obilježje ove skupine bolesti.

"Bolesti, oštećenja i tumor maksilofacijal"
ed. AK Iordanishvili

Dijelite na društvenim mrežama:

Povezan