Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.

UtverzhdenyGlavnym gosudarstvennymsanitarnym vrachomRossiyskoy Federacija -First zamestitelemMinistra zdravoohraneniyaRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO9 siječanj 1998 godaData uvod - 8. lipnja 1998 goda4.2. Metode kontrole. Biološka Mikrobiološka Dijagnoza difterije FAKTORYLABORATORNAYA INFEKTSIIMETODICHESKIE UKAZANIYAMU 4.2.698-981. Savezni službenici dizajniran referenca - laboratoriidiagnostiki difterije infektsiiMoskovskogonauchno Institut za istraživanje epidemiologije i mikrobiologije im.G.N. Gabrichevskogo (MD Mazurova IK, MD Melnikov k.b.n. Kombarova S., O. Borisova) i DepartamentomGossanepidnadzora ruskog Ministarstva zdravstva (Žilina NY .2). Odobreno i staviti na snagu glavni gosudarstvennymsanitarnym liječnika iz Ruske Federacije, prvi zamestitelemMinistra zdravstva Ruske Federacije od 8. travnja 1998. D.3. VvedenyvzamenMetodicheskihukazaniy4.2.589-96"Laboratorijske dijagnoza infekcije difterija"0,1. Površina primeneniyaMetodicheskie smjernice sastavljene kako bi se spetsialistambakteriologicheskih sanitarne laboratorije - epidemiologichoskoysluzhby, zdravlje - ustanova za njegu i znanstveno istraživački institut za poboljšanje laboratornoydiagnostiki difterije infektsii.2. Karakteristike uzročnika difterije infektsiiVozbuditelem difteriynoyinfektsiiyavlyayutsya toksigennyeCorynebacterium diphtheriae. Nontoxigenic Corynebacterium difterije difteriine uzrok infekcije. "etiološki" etihmikroorganizmov značenje kada infektivne bolesti (faringitis, artritis, endokarditis, itd), zahtijevaju posebnu dokaz. Kada vydeleniinetoksigennyh sojeva C. diphtheriae pacijenata s infekcijom sumnja nadifteriynuyu treba obratiti pozornost na pravilnostprovedeniya bakteriološkog pregleda i evaluacija na temelju sposobnosti toksigennyhsvoystv.V C. diphtheriae proizvodi ekzotoksinlezhit fenomen faga (ili lizogene) pretvorbu. Konversiyanetoksigennyh sojevi C. diphtheriae u naoborotvosproizvoditsya Toksikogene i samo u određenim eksperimentalnim uvjetima., U tehsluchayah kada tijekom početne sađenja izoliranog materijala Toksikogene otbolnyh difterije, a povtornyhobsledovaniyah nakon antibiotske terapije - netoksigennyekorinebakterii difterije, može se pretpostaviti da kada ispolzovaniiantibiotikov uglavnom nestane Toksikogene sojevi osjetljivi kakbolee njihovom djelovanju, a nontoxigenic shtammyprodolzhayut dodijeljen. Ista situacija može biti izrađen i prisanatsii antibiotici bakterije nosioci, a istovremeno vydelyayuschihtoksigennye nontoxigenic Corynebczcterium difterije. Otkrivanje Utaka mediji u ponovljenim istraživanjima samo netoksigennyhshtammov ne može se tumačiti kao gubitak sposobnosti shtammovprodutsirovat ekzotoksin.Taksonomicheski neposrednoj pogledom C. diphtheriae su C.ulceransi C.pseudotuberculosis (C.ovis). Ovi mikroorganizmi - prirodnyepatogeny goveda i sitne stoke, konja. Otmechenasposobnost ove vrste bakterija proizvesti toksin podobnyydifteriynomu. Tu su i "nontoxigenic" sojevi. raspodjela Izvestnysluchai "Toksikogene" C.ulcerans kliničke kartinezabolevaniya slične difteriey.Na oropharyngeal sluznicu nosa i normalnog chastovstrechaetsyalozhnodifteriynayapalochka Hoffmann (C.pseudodiphtheriticum). Sposobnost da se izolira i identifitsirovatdannye bakterije služi kao kriterij u procjeni kvalitete rabotybakteriologov interepidemic period.Vse mikroorganizmi Corynebacterium yavlyayutsyagrampolozhitelnymi štapovi ne tvore spore obladayuschimirazlichnoy stupanj polimorfizma. Većina vrsta raste bolje vaerobnyh usloviyah.Obychno kolonije mikroorganizmi Corynebacterium naplotnyh hranjivim (npr, na krvnom agaru) - imeyutserovato bijele ili žućkastih, neprozirna ilipoluprozrachnye, okrugli oblik, promjer 1 - 3 mm. Najčešće onibyvayut mekani, mastan dosljednost, iako neke vrste rodakorinebakteriimogutobrazovyvat grubi R-kolonii.Predstaviteli ove vrste nemaju visoku fermentativnoyaktivnostyu. C.diphtheriae rastu na 37sh C, otporna na nizkoytemperature osjetljiva na visoke. Svi dezinfekciju veschestvav uobičajene koncentracije (3 - 5%) korinebakteriidifterii uništiti u roku od 20 - 30 minuta. Toksikogene C.diphtheriae boleechuvstvitelny na antibiotike nego nontoxigenic. Vozmozhnopoyavlenie antibiotike rezistentnih sojeva. Široko opredelyatchuvstvitelnostkantibiotikam izolata otbakterionositeley ne treba zbog uzorak ne podudara rezultatovlaboratornoy na djelovanje antibiotika na tijelu vozbuditelyadifterii cheloveka.Dlya C.diphtheriae naznačen značajno polimorfizma -raznoobrazie veličinu i oblik stanice. Stanice imaju oblik klubovi, reketi, itd estrusa stanica interpozicija podsjeća rimskietsifry X, V. Kada se boja često naći vyrazhennayavnutrikletochnaya striation, zbog prisutnosti zerenvolyutina. Afinitet opisani volutin u metilen plavo i one priobrabotke bojila granule ili trake (clustera granula) mrlja plave boje, a u nekim protoplazme sluchayahmozhet stjecanja rozovyyottenok.Ispolzovanievbakteriologicheskoy okraskipoGramuyavlyaetsyanetselesoobraznym prakse, ili čak poskolkukletkiC.diphtheriaelegkoobestsvechivayutsya spirtomimogutvyglyadetvmazkegramvariabelnymi gramotritsatelnymi.Dlya C.ulcerans i C .pseudodiphtheriticum sklonnostk karakteriziran paralelna stanica. 24 - 48 h kulture etihvidov su često jajoliki oblik kletok.Po oblik kolonije i neki biokemijski svoystvamC.diphtheriae podijeljene u kulturno - biohimicheskievarianty - gravis, mitis, intermedius.Cherez 48 - 72 sati rasta mitis varijante oblikuje tip koloniiS - glatka, promjer od 1 - 2 mm-varijanta SR-gravisobychno konveksnih kolonija s povišenom centar promjera 2 - 3 mm kolonija izvedba intermedius - s-tipa, mala, ravna, glatka, sravnjena promjer ruba 0.5 - 1 mm. U nastavku se opisuje samo dvakulturalno - biokemijske izvedbe - gravis i mitis, tako kakbiovar intermedius rijetko i biokemijski svoystvamne razlikuje od biovar mitis.Na telluritovyh krvi medija nakon 48 sati rasta koloniiC.diphtheriae izvedba gravis, kao kolonija C.ulcerans, crna, mat imaju radijalnu striations. KoloniiC.pseudodiphtheriticum imaju karakterističan svjetlo obodok.V bakteriologicheskoypraktikeopiratsyatolko namorfologicheskie svojstva kolonije ili mikrobnih stanica priidentifikatsii C.diphtheriae, nije moguće. Opisanysluchai bakteriološki hipo- i hyperdiagnostics (55% i 14,5%, respektivno) kada se koriste uchettolkomorfologicheskih znakova. Kada identificiranje C.diphtheriaeneobhodimo korištenje testa kompleks prvenstveno patogenost (toxigenicity) Glavni priznakavozbuditelya difterii.Opredelenie Toksikogene svojstva provedena bacteriologists prvi dan rasta sumnjivih kolonija na pločama pervichnogoposeva materijala. Kako bi izbjegli greške u coryneform bakterija određivanje toksigennyhsvoystv, potrebno je proučiti ovaj pokazatelj umaksimalnogo broja kolonija sa pladnjeva primarnih usklađenosti tehnika poseva.Pri opisani u nastavku mogu se proučavati toksigennostbolee od 20 sumnjivih kolonija iz jedne analize. Nelzyaizuchat materijala na množinu rasta sumnjive koloniytolko jedan - dva blyashkah.Fermentativnaya djelovanja mikroorganizama istraživanog putemopredeleniya tsistinazy enzim ureaza, sposobnost da cijepa dokisloty glukozu, saharozu, škrob, U rijetkim slučajevima, kogdaneobhodimo identificirati C.ulcerans, dodan ispitni navosstanovlenie nitrate nitrity.Uchityvaya kad difteriynoyinfektsii identifikacija patogen vodeća elementa je određivanje prisutnosti toksina otsenkidrugihsvoystvimeet pomoćnog znachenie.Ispolzovanie "dugo" ugljikohidrata je broj suvišne priidentifikatsiya C.diphtheriae.Prakticheskimbakteriologam sudjelovali u laboratorijskoj dijagnostici difterije, ne trebuetsyaprovodit identifikaciju vrstama drugih mikroorganizama rodaCorynebacterium. U isto vrijeme, u laboratoriju, gdje provoditsyadiagnostika bolesti uzrokovane "nedifteriynymi"Corynebacterium, nedovoljna upotreba i "dugo"ugljikohidrata red. Za točne podatke identifikacijski mikroorganizmovneobhodimo koristiti chemotaxonomic istraživačke metode, kao što je utvrđivanje prisustva mycolic kiseline, stanične stijenke bakterije i neki način vsostave drugie.Takim mikroorganizam odabran vozbuditelemdifterii ako ima Toksikogene properties opredelennymspektrom enzimske aktivnosti (cijepanje glukoza, škrob, izostanak razgradnje saharoza enzim tsistinazy prisutnost, odsutnost fermentaureazy) i karakteristične morfološke -kult uralnymi znakovi (formacije kolonije na crno ili serogotsveta krovyano - telluritovyh okruženja prilagođen, prineobhodimosti, morfologija stanica - polimorfni ne tvori sporpalochki) .3. IssledovanieBakteriologicheskoe bakteriološki studije su provedena na laboratornoydiagnostiki infekcije difterije, identificirati izvore zaraze za prevladavanje Toksikogene inablyudeniya korinebakteriidifterii.VZYaTIE i isporuka MATERIALA1. Uspjeh bakteriološkog pregleda u znachitelnoystepeni ovisi o pravodobno i precizno hvatanje materiala.2. Uzimajući materijal mora posebno obuchennyemeditsinskie zdravstvenim - Njega uchrezhdeniy.3. U istraživanju se ispitalo orofarinksa i difterija nos.Pri Difterija rijetke lokalizacije (oči, uši, rana, kože, vagine) osim lezije također treba uzeti materijal iz smindalin nosa.4. Uzimanje materijala se provodi uporabom sterilnih brisevi vatnyhsuhih. Njihove priprave pomoću drveni ilimetallicheskie (od nehrđajućeg čelika), jedan od šipki kontsovkotoryh dobro zacjeljivanje sloj apsorpcijskog pamuka (primerno120 mg pamučnom krpom). Tamponi treba biti u obliku "kapi"i ne"vreteno", Tamponi su montirani u epruveti s pluta ili vatnymiprobkami tako da je kraj tampon ne dotakne dno i stenokprobirki. Sterilizirati tampone u vrućoj zračnoj peći na temperature140sh C jedan sat ili autoklaviranjem na 0,5 atm. 30 Min.5. Materijal od orofarinksa i nosnog obriska uzimaju pojedinačni prazan želudac ili ne ranije od dva sata nakon obroka, kad horoshemosveschenii, špatulom, bez dodirivanja ivnutrennih površine bris jezične obraza i zuba. Jedan štapić sobirayutmaterial s lezijama oropharynx - krajnika i prineobhodimosti - s lukovima mekog nepca, resica ili ždrijela zadneystenki. U prisutnosti plaka, materijal treba uzeti sgranitsy bolesnog i zdravog tkiva, lagano pritiskom na nihtamponom. Za uzimanje tvari iz nosa pomoću drugog štapića koji je uveden prvo u jednom, a zatim se u drugu nosnicu, nekasayas snaruzhi.6 nosnice. Kada laringoskopijom materijal (sluz film) sobirayutneposredstvenno grkljana. Materijal sa lezijama kozhisleduet skupljati suhe obrisak nakon uklanjanja kore ili strupa.7. Tamponi su bytdostavleny u laboratoriyunepozdnee 3 sata nakon uzimanja materijala. Kada provedeniiobsledovaniya kontingenata u udaljenim bakteriologicheskihlaboratory područjima, preporuča se da se biljni materijal na šalicu spitatelnoy okoliš ili koristiti transportni sredu.8. U slučaju prometne srednje materijala sobirayutsuhim obrisak umočen u epruveti s okolinom i osigurati da utikač nije mokro obrisak. Imajte na umu da primenenietransportnoy okoliš proširuje izdavanje finalnoj otvetana jedan sutki.9. Cup (ili epruvete sa transportnog medija) uz posevomissleduemogo materijal može se postaviti za uzgoj pri vtermostat 37sh C 15 - 18 sati, nakon čega se isporučuju vlaboratoriyu.10. Tijekom transporta na velike udaljenosti kao tamponi mozhnoispolzovat prethodno namočeni rastvoromglitserina. Tampon impregniran sa 5-postotnom otopinom glicerin vdistillirovannoy vode isušen na stijenku posude s otopinom, poboljšati in vitro, kao i kemijska i bris autoklavu pri0,5 atm. 30 Min.11. Hladna sezona ispitni materijal isporučuje u vrećama vbaklaboratoriyu - termosice, kako bi se spriječilo zamerzaniya.12. Vsluchaeneobhodimosti od Corynebacterium difterije u materijalu postmortalnyhissledovany tselesoobraznobrat s tonzile, grkljana i nosnoj šupljini kao u vnutrennihorganah redko.13 patogena otkriven. Svaka cijev s materijalu (ždrijelo, nos) ilidrugaya lokalizacije vezan na broj. Priloženi cijev spiskeukazyvaetsya broj, prezime, ime (ili inicijale), dob, naziv institucije, vodič materijal ili kuće adresobsleduemogo, svrha istraživanja (s dijagnostičkim ukazaniemdiagnoza, na temelju epidemioloških indikacija, preventivna skrb), datum uzima materiala.HOD istraživanja. PRVI DENPosev materiala.Material za istraživanje dušnik, nazalni ili drugihporazhennyh sjedala odvojeno zasijana na površini guste hranjivih medija izrekomenduemyh izliveni u šalice Petri.Posev od jednog lica za proizvodnju jednu šalicu pomoću prietom pola površinu sjemena srednje izrotoglotki materijala, a drugi - za usjeva materijala iz nosa. Kada posevemateriala od kože ili drugim mjestima dodati još jednu šalicu. Nije dopušteno količina materijala od nekoliko pojedinaca po chashku.Pri sijanje materijala utrljava u mediju sa svih strana tampona nauchastke površinu od 2 x 1 sq. cm - formiranje takav "igralište"To je potrebno. Zatim taj isti bris inokulira ostavshuyusyapoverhnost 1/2 šalice. Sjetva se dobije često neperekryvayuschimisyashtrihami bez uklanjanja tampon od površine hranjivom mediju i nepromjenjiv položaj tampon. Ova metoda omogućuje zaseyatves Cjepivo sa tampona da bi se dobio izolirane kolonije (chistuyukulturu) za daljnje identifikacije sjetve direktno chashkepervichnogo da skraćuje ispitivanje odnisutki. Inokulirane ploče ili cijevi koje sadrže sredstva za transport pomeschayutv termostat na 37sh C sjetve transportnog medija za proizvodnju nasljeđivanja dana medij gusta bris ostenki pritisne cijevi ili petlje, da se materijal iz osadka.Posev treba izvesti na pločama s medijem, temperatura ili zagrijanom prikomnatnoy u inkubatoru (15 - 20 minuta) .VTOROY day1. Kolonije su rasle na ploče od 24 do pregledavanja chasaposle materijal za klijanje (ako je materijal se stavlja u drugi polovinednya, gledanje je učinjeno u točno 24 sati, tj također Druga polovica dana), bilo vizualno ili pomoću stereoskopski mikroskopabinokulyarnogo (MBS) .2. Šalice s kolonijama, kao što su difterija, uzeti dlyadalneyshey prepoznati kulturu u svim testovima. Mikroskopiipreparatov - brisevi "sumnjiv" Kolonije mogu biti neprovodljiva. "sumnjiv" kolonija krovyano - telluritovyhsredah nakon 24 sati svjetla rasta - siva, konveksni, sravnjena rubova, 48 sati - siva s metalnim ton, srovnymiili blago nazubljene rubove, mrvi priprikosnovenii petlje ili je mekan. od "neizvjestan"Kolonije se pripremili pripravci - mazki.Kletki Corynebacterium difterije iz kulture uzgojene na sredahs inhibitori rasta (kalij teluridna, hinozol) mogu bytukorocheny, obložen, ali njihov položaj i svojstvena polimorfizmsohranyayutsya. Procjena morfoloških osobina ne pozvolyaetustanovit vrsta mikroorganizama, ali daetvozmozhnost trebalo da se to roda korinebakteriy.Esli mikroskopije pokazuju coli karakterističnim rodakorinebaktery ove kolonije su odabrani za dalneysheyidentifikatsii u svim testovima. U slučaju drugih formmikroorganizmov (koka, kvascu, spore polužja), ove kolonije dalneysheeizuchenie prekraschaetsya.3. U slučaju rasta "sumnjiv" slični kolonije treba odmah nastaviti s proučavanjem njihovih svojstava Toksikogene svoystv.Toksigennye studija ne manje od 2 izolirovannyhkolony za sadnju polovicu svakog od kolonija u srednjem dlyaopredeleniya toxigenicity i nerastaljenom petlje, - na Pise mediju, a druga polovica od kolonija - u cijev s Ukošena syvorotochnymagarom za konzerviranje i akumulacije kulture. Kada nevozmozhnostisnyat 1/2 kolonije za sijanje na toxigenicity i na srednje Pizuispolzuetsya materijala kolonii- cijeli urod na agarisklyuchaetsya zakošenim i, dalje, od cijevi kulture koriste sproboy Pisi. S obzirom da se nakon 24 sata rasta veličinama kolonija i materijala imeyutnebolshie 1/2 ili 1 kolonije mogu bytnedostatochno za nakupljanje toksina difterije u uzorku natoksigennost, te da je u materijalu mogutnahoditsya istovremeno Toksikogene i nontoxigenic raznovidnostikorinebaktery difterije, bitno je da se ispitati toksigennyesvoystva po moguće, maksimalan broj kolonija (preko 20), za miješanje od 5 - 7, jedan sličan blyashku.4 kolonije. Ako je nemoguće da uzorak postavljanje toksigennostklassicheskim metoda (vidi, P. 3) zbog nedovoljne velichinykolony, njihovoj studiji, miješanje istog tipa kolonije neskolkihblyashkah. Ne gori kroz petlju, cijepljenu srijedu Pisi. Šalice spervichnym sjetve test materijal je ponovno stavljen vtermostat za 24 sata, te ih ponovno pregledavanje (po tretisutki) .5. Ako je samo jedna kolonija raste, može se sijati nasredu za određivanje toxigenicity i bez spaljivanja petlju na stolbiksredy Pisi kako bi se utvrdilo tsistinazy. Identifikatsiimozhno za daljnju uporabu cijevi za kulturu s uzorkom ili Pisi blyashkicherez 48 sati rasta ili 24 sata rasta na vyyavlennyhtoksigennyh kultury.6 svojstva. Kako bi se pokrenulo preliminarni odgovor na rast kolonija sluchaemnozhestvennogo sumnjivim mogu proizvestiposev nekoliko kolonija u tekućem mediju dlyapostanovki Phragmites, Sachse napuniti još uzorka (3 -5 slični kolonije držanje nakon 30 minuta inkubacije.) I Pisa uzorka (5 - 6 slične kolonije , što čini kroz 3 sata inkubacije). Priharakternoy za Corynebacterium difterije u MBS kolonija, stanične morfologije pomoću mikroskopije, Sachse negativan uzorak, a uzorak pozitivni rezultati Pisa, Phragmites može vydatpredvaritelny odgovor na detekciju kulture sumnjive nakorinebakterii difterije nakon 48 sati (na treći dan) uz sijanje momentapervichnogo istražena materiala.TRETY day1. Nakon 24 sata, kada je specifična liniypretsipitatsii na medij za određivanje, toxigenicity polozhitelnoyprobe na tsistinazu, proučavali kulture prepoznaje kakkorinebaktery Toksikogene difterije i izlaz dokumentirovannyyotvet.Pri odsutnost specifičnih precipitinsku linije na srednjem dlyaopredeleniya toxigenicity, ploče su inkubirane tijekom još 24 chasa.2. Kultura se uzgaja na agara ili serumu sproby Pisa (nakon procjene njegove čistoće) nasađene su u mediju dlyaopredeleniya biokemijskom izvedbi (saharoza, glukoza, škrob) ifermenta ureaze (hidroliza uree) .3. Ploče s primarnim inokulacijom issleduemogomaterialaprosmatrivayut vizualno ili pomoću ponovno MBS 36 -48 sati inkubacije u inkubatoru. U nazočnosti "sumnjiv"Kolonije studija njihove Toksikogene properties tsistinaznuyu aktivnost ivydelyayut čistu kulturu na agaru skoshennyysyvorotochny (cm, druga studija dan, str. 3) .Ako bez kolonija sumnjivih korinebakteriidifterii, čime se dobije konačni odgovor koji Corynebacterium difteriine vyyavleny.Pri nikakav rast na agaru početnog sađenja cherez48 sati inkubacije, u nekim slučajevima zahtijeva ponavljanje uzimanja iissledovanie materijala. Potpuna odsutnost rasta često vsegosvidetelstvuetonarusheniipravilbakteriologicheskogoobsledovaniya (preuzimanju, sadnog materijala i kultivirovaniyaissleduemogo) .CHETVERTY dana (ili petog) 1. Kada su posebne linije precipitinsku dlyaopredeleniya toxigenicity okruženje (24 sata inkubacije, uzorci natoksigennost 48 sata rasta primarnog zasijavanje) kako bi se dobilo polozhitelnoyprobe tsistinazu dokumentirani odgovora vydeleniitoksigennyh difterii.2 Corynebacteria. Kultura se uzgaja na agara ili serumu sproby Pisi nakon određivanja čistoće, inokulira se na medij dlyaizucheniya biokemijskih svojstava (zviždati mediju s saharoza, glukoza, škrob, Sachse uzorka s ureom ili smjese) .3. Opet (nakon 48 sati) uzeti u obzir rezultate uzorka natoksigennost pozirala za vrijeme Dana 2. studije. Odnovremennoproizvodyat saccharolytic svojstva vođenja i aktivnost ureaze vprobah postavljene na 3 dan issledovaniya.Pri nema posebnih precipitinsku linija 48 chasovposle pripremna uzoraka na toxigenicity ali polozhitelnyhrezultatah uzoraka za tsistinazu, glukoza, ureaza negativne rezultatahprob i saharoza, kulture su identificirani kakkorinebakterii difterija nontoxigenic, ukazuje biohimicheskogovarianta.Pri izolaciju Toksikogene Corynebacterium difteriidopolnitelno daju odgovor o biokemijskoj Svo tvah (72 ili96 sata nakon početnog sađenja materijala) .BAKTERIOLOGICHESKOE ZAKLYUCHENIE1. Prisutnost specifičnih precipitinsku linija s opredeleniitoksigennyhsvoystv, pozitivan test za tsistinazu, negativan test za ureaze, kultura ibiohimicheskie karakteristična svojstva (saharoza, glukoza, škrob), koji se odnosi na pozvolyayutzaklyuchit kulturama izoliranih korinebakteriydifterii um Toksikogene, biokemijski ili mitis.2 izvedba gravis. Odsustvo određenih linija s precipitinsku opredeleniitoksigennyhsvoystv, pozitivan test za tsistinazu, negativan test za kulturu, ureaza ibiohimichekie karakteristična svojstva omogućuju nam zaključiti da izolirani kulturaotnositsya na vrste Corynebacterium difterije, nontoxigenic, biokemijski ili mitis.3 izvedba gravis. U prisutnosti precipitinsku linija identična kontrola spetsificheskimliniyam strain Corynebacterium difterije, polozhitelnyhprob ureaza, tsistinazu, glukoza ili škrob fermentacije, odsutnosti saharoze fermentacije vnitrity redukcija nitrata, kultura pripada coryneform ultserans um Toksikogene variant.Pri ne precipitinsku linije pri određivanju toksigennyhsvoystv i ste sve ostale značajke karakteristične dlyakorinebaktery ultserans, nontoxigenic opcija ibakteriologichesky odgovor smatra negativnim ym.4. Kada odaberete Chlamydia Gofmanailidrugihdifteroidov, bakteriološki odgovor otritsatelnym.5 vjeruju. U nekim slučajevima, kada se dijagnostički pregled i poepidpokazaniyam, preliminarni odgovor može dati. Etotrebuet postavljanje dodatnih uzoraka, prisutnost kachestvennyhpitatelnyh okruženja, test - sustavi za proizvodnju i Phragmites spetsialnoobuchennogo osoblja. Privremeni odgovor može se izdati višestruki rast slične prinalichii "sumnjiv" koloniyna početnog sađenja posude nakon 24 sata inkubacije (vidi, vtoroyden studije, br. 6) .Predvaritelny odgovor može mijenjati nakon okonchaniyabakteriologicheskogo issledovaniya.6. Sojevi Corynebacterium difterije atipichnymimorfologicheskimi, biokemijski, svojstva Toksikogene Corynebczcterium ishtammy ultserans treba uputiti federalnuyureferens - laboratorij za dijagnozu infekcije difterije priMoskovskom Research Institute of Epidemiology i mikrobiologiju im.G.N. Gabrichevskogo za daljnje studije (125.212 Ul Admiral Makarov, 10). Shema bakteriološka studies1 denPosev issleduemogomateriala na selektivnuyudifferentsialno - dijagnostičkog ili, ako je potrebno, vtransportnuyu mediju. Inkubacije u inkubatoru na 37sh C.2 dana (24 sati) 1. Studija kolonije, ako je to moguće - na postanovkaproby toxigenicity, tsistinazu i sjetve kulture skoshennyysyvorotochny agar.2. Prilikom korištenja transportnog medija mora biti proizvestiperesev na selektivnoj diferencijala - dijagnostički sredu.3. Kada višestruki rast, ako je potrebno, mozhnoprovesti studije za izdavanje prethodnog odgovora -dodatne uzorak Pisa, Sachse i usjeva "sumnjiv" koloniyv tekući medij za detekciju toksin difterije vRNGA.3 dana (48 sati) 1. Profitabilnost Analiza uzoraka za toxigenicity i tsistinazu postavljene na drugi dan studije. Ako nalichiyaspetsificheskih oborinskih linije i pozitivnog uzorka Pizuvydayutdokumentirovannyyotvet dodjela toksigennyhkorinebaktery difterii.2. Sjetve čistu kulturu odabran drugi denissledovaniya, zviždati u mediju za proučavanje biokemijskih svojstava (saharoza, glukoza, škrob, urea) .3. Ponovni (48 sati), primarni posevavizualno čaše ili pomoću MBS. Odmorišta testovi za toxigenicity, tsistinazu i testiranje kolonijama na serum agar.4 koso. U slučaju prometne okoliša, naravno issledovaniyasm. počevši od br. 1 drugog dana i zatim na skheme.5. Vydachabakteriologicheskogootvetaobotsutstviikorinebaktery difterii.6. Prilikom postavljanja RNGA detektirati toksin difterije prinalichii pozitivan rezultat u ovoj reakciji i otkrivanje uissleduemoy kulture tsistinazy enzima odsutnosti fermentaureazy može dati prethodno odgovor za dodjelu vozbuditelyadifterii.4 dana (72 sati) 1. Čini kulturu Toksikogene svojstava odabrani denissledovaniya 3 (nakon 48 sati rasta primarnog zasijavanja), i reakcije za raspodjelu vydachadokumentirovannogo Toksikogene korinebakteriydifterii. Sijanje kulture odabrane za određivanje biohimicheskihsvoystv (saharoza, glukoza, škrob, urea) .2. Računovodstva kulture biokemijska svojstva (Toksikogene ilinetoksigennoy) raspoređeni u drugi dan studije (cherez24 inkubacije početnog sađenja) .Vydacha bakteriološka odgovor raspodjela netoksigennyhkorinebaktery difterije ukazuje idopolnitelnogo izvedbom biokemijski odgovor biokemijskih svojstava difterije toksigennyhkorinebaktery dodijeljenih ranee.5 dana (96 sati) izdavanje raspodjele bakteriološkog odgovora (48 chasovinkubatsii početnog sađenja) ili Toksikogene netoksigennyhkorinebaktery difterija y Azan biokemijski varianta.4. Metode identifikacije patogena difteriynoyinfektsiiOPREDELENIE Toksikogene KORINEBAKTERIYDIFTERII svojstava uporabom reakcija precipitacije u postupku gel bazi za određivanje toxigenicity korinebakteriydifterii (Elek test) leži Postupak immunodiffuziitoksina brojilo i antitoksičan antitijela u gustoj hranjivom mediju. Umjesto optimalnog kvantitativnog odnosa između toksina produkciji Corynebacterium i antitoksin nafiltrovalnuyu premazan papir je njihova interakcija s obrazovaniempretsipitata obliku bijele linije ili "brkovi".Toksigennost Corynebacterium difterije određen, obično u čiste kulture (kultura ili pojedinačnih kolonija s skoshennogoagara ili uzorak Pisa). Kolonije se smjesa ili kulture zagryaznennyepostoronneymikrofloroy mogu se također ispitati natoksigennost. U nedostatku, u ovom slučaju, gel taloži vagarovom iskustvo treba ponoviti s namjenskim chistymikulturami.Dlya produkcija uzoraka za toxigenicity mora imati: sterilne Petrijeve posude s ravnim dnom, hranjivi medij - agarMartena ili suhog medija komercijalni hranjivih normalnuyusyvorotku krvi goveda, sterilna izfiltrovalnoy papirnim trakama za mjerenje 1,5 cm x 8 cm, ochischennyyfermentolizom specifične sorpcije i difterija protuotrov (vdalneyshem iz antitoksin) protivodifteriynuyuantitoksichesk th konjskog seruma, terapeutski (u serumu dalneyshemimenuetsya antitoksičan) ili gotovi papir diskis protuotrov primjenjuju na njih, i - kontrolnyytoksigenny Corynebacterium Soj difterije 24 - 48 sata rosta.Prigotovlenie čašica za postavljanje probyna toksigennostPitatelny agar odrediti toxigenicity tselesoobraznorazlivat cijevi 10 ml (količina potrebna dlyaprigotovleniya jedne šalice). Kada je velika količina radne pitatelnyyagar puni u bočice za 70 - 80 ml (7 - 8 uzorak šalice natoksigennost). Hranjivi agar treba rasplavlivat tolko1 više različitih topljenje narušava svojstva medija. Pitatelnyyagar rasplavlivayut u vodenoj kupelji pri 90SH C odmah ukloni izbani, ohladi na 50sh C i doda se 20% seruma goveda krupnogorogatogo. Tako, do 10 ml hranjive agar doda se 2 mlsyvorotki stoku, miješa i aseptički se prelije u sterilnu petrijevku, dno raspredelyayutsosedu paziti rotacija chashki.V središte čašice na površini agara otvrdnjavanja obozhzhennympintsetom stavljen filter papir trake (propitannuyuantitoksinom ili antitoksičan serum) .Chashku suši u peći na 15 ° C 37sh -20 min., okrećući naopačke. Kada se koristi bumazhnyhindikatornyh vozi hranjivi agar ploča osuši donaneseniya sredy.Chashki diskova na površinu medija za određivanje toxigenicity pohraniti nerekomenduetsya.Prigotovlenie papir polosokPoloski filter papir smanjiti na veličinu od 1,5 cm x 8 cm, omotan s 2 - 4 komada u vreću i sterilizirati u avtoklavepri 0,5 atm tijekom 30 minuta. Vrećice s papira poloskamihranyat u sterilnu petrijevku do 3 nedel.Pered uzorka odmorišta u toxigenicity santitoksinom sadržaj bočice se otopi u 1 ml sterilne fiziologicheskogorastvora, prenesena u sterilnu epruvetu i pokazuju neydannye oznake (otopljen protuotrov temperature4 pohranjene na - 6sh C ne prelazi 10 dana) , Filter papir postavljen na obozhzhennympintsetom sterilnu petrijevku. U svakom poloskunanosyat antitoksin 0,25 ml sadrži 500 ME u 1 ml. Dlyaudaleniya traka nanosi poklopca ksterilnoy šalica suvišak serum navlaži Petri.Pri koristeći antitoksičan seruma (vmestoantitoksina) zahtijeva svoju razrjeđivanje do 500 ME 1 ml.Razvedenie antitoksičan syvorotkiSoblyudaya aseptički tehnika antitoksičan perenosyatiz seruma bočice u sterilnu epruvetu. Na cijevi pokazuju dannyeetiketki i rok trajanja. Pohraniti pri 4 ° C serum -6sh C.Syvorotka mora se razrijediti sa sterilnom sadržajem fiziologicheskimrastvorom 500 ME u 1 ml. Komercijalni pripravak mozhetimet različitu aktivnost (5000 ME, 10000 ME, 20000 ME) i razlichnyyobem.Naprimer u ampuli sadrži 10000 ME (u volumenu od 4,8 ml, kakukazano oznaka kutiju ampula) antitoksičan syvorotki.Dlya pojednostavljenja izračun, ukupna količina može biti serum uzeti za5 ml. Prema tome, u 1 ml seruma sadržavala 2000 ME (10000 ME: 5 = 2000 ME). Da bi se dobio serum sleduet1 ml 500 ME u 1 ml razrijeđena 4 puta, tj do 1 ml seruma dobavit3 ml sterilne fiziološke otopine. Kada neobhodimostimozhno razrijeđen u serumu manje količine: 0,1 ml syvorotkidobavit u 0,3 ml fiziološke otopine ili 0.2 ml syvorotkidobavit 0,6 ml fiziološke otopine ili 0,3 ml 0,9 syvorotkidobavit ml otopine soli i t. d.Razvedenie serumu se može obaviti na drugi način. Ako, na primjer, sadržana u ampule 5000 ME serumom u volumenu od 2,5 ml, ME 500 je sadržan u 0.25 ml seruma. Za ovaj Volumen dobavlyayut0,75 mL sterilne fiziološke otopine i serumu poluchayutrazvedenie 500 ME 1 ml.Razvedennuyu serum može biti pohranjen tijekom 7 dana na temperature4 - 6sh C.POSTANOVKA PROBYKulturu zasije u "plakete" promjer za 0,6 - 0,7 cm narasstoyanii 0,7 - 0,8 cm, i 0.5 cm u razmaku od ruba poloskifiltrovalnoy papira. Jedna šalica treba biti posađeno više od 10 "plakete", Od tih, 6 "plakete" Test kulture 4 -kontrolnogo soja. Kada se mala količina cijepljenu ispytuemogomateriala 6 kontrolom "plakete" i 4 - predmeti (Slika 1. *>). Čaše s sjetvu stavljena je u termostatu na 37sh C * .--------------------------------> Ne privoditsya.Uchet rezultatovRezultat čitanje na 18 - 24 i 48 sati rosta.Sleduet Razumljivo chtopreparatantitoksicheskoyprotivodifteriynoy seruma, uz difteriynomuantitoksinu antitijela sadrži antitijela na antigene u formulaciji mikrobne uzorka kletki.Poetomu da toxigenicity ispolzovaniemdannogo s taloga lijeka može se dobiti ne samo vrezultate povezuje s toksin antitoksin (spetsificheskiepretsipitaty), ali i u interakciji antibakterijskih antitijela skomponentami Corynebacteria stanica d ifterii (nespetsificheskiepretsipitaty). Potonji se može formirati kao u Toksikogene, pogrešno broj i kontrolni soj i na netoksigennyhkorinebaktery difterije. Ponekad je pojava mnozhestvennyhliny oborina. Nespecifične talozi obično blage, imaju nejasni obrisi najviše pojavljuju 48 -72 sati, u rijetkim slučajevima može se pojaviti na prvoj sutki.Kriteriem procijenila specifičnost fuziji precipitata je liniypretsipitatsii Test soj sa specifičnim liniyamikontrolnogo Toksikogene naprezanja. U slučajevima kada ukontrolnogo soj formirana nekoliko redaka oborina, specifično treba smatrati točniji i rano poyavlyayuschiesyapretsipitaty. Dakle, gledanje posudicama na toksigennostosuschestvlyayut nakon 18 - 24 sati od trenutka njegove proizvodnje. Ako vtechenie ovaj put s upravljačke soj pretsipitatsiine linije su otkrivene, to predstavlja kršenje usloviypostanovki reaktsii.Varianty ocijeniti odgovor rezultata: 1. Test kultura Corynebacterium difterije yavlyayutsyatoksigennymi da tvore oborina linije spajanja iliimeyut sklonost spajanju s odgovarajućom kontrolnom spetsificheskimiliniyami Toksikogene shtamma.2. Test kultura Corynebacterium difterije yavlyayutsyanetoksigennymi: a) ako je linija formirana precipitacije ispitivanog kulture odsutan prisutnost određenih linija za taloženje skladu taloženja ukontrolnogo soja b) ne može spojiti s kontrolnom spetsificheskimiliniyami taloženje soja i prešla ili imeyuttendentsiyu križanje s njima (različita , nespetsificheskielinii) -c) retka precipitinsku testnog Kultura snespetsificheskimi linije spajanja kontrole soj-d) taloženje ispitivanje linija kult URS sospetsificheskimi linije sijeku i spajanje s nespecifično liniyamikontrolnogo shtamma.Ochischenny enzimska hidroliza i specifični sorpcije protuotrov Ne sadrži antitijela komponentama stanica mikroba. Kada ispolzovaniietogo priprema nespecifični precipitinsku linije ne obrazuyutsya.METODIKA Toksikogene SVOYSTVKORINEBAKTERY određivanjem s difterije INDIKATORNYHBUMAZHNYH disk s ANTITOKSINOMNa Petrijevoj zdjelici površine s medijem za mikrobnih stavljen opredeleniyatoksigennosti Difterija indikatorskih kotača sdifteriynym antitoksin. Oko svakog diska 5 antitoksinomformiruyut "plakete": dva "plakete" - kontrolni soj i tri -ispytuemye (jedna analiza barem dva sumnjiva koloniyamiformiruyut "plakete" od izoliranih kolonija i -Od smjesu od 3 - 6 koloniy- slične slike iz istog analizamozhno odvijati oko drugog diska antitoksin). Svih pet"plakete" su smješteni simetrično oko diska na udaljenosti od 0,8 smot rub. Promjer svake "plakete" 0,8 cm. U jednoj šalici Petrimozhno primiti do četiri diskova protuotrov i odnosno 20 "plakete" kulturama. Čaše s posevamipomeschayut u termostatu na 37sh C.Rezultat reakcijom čitanje nakon 18 - 24 sati i 48 sati -through. Prisutnost oborine linija između santitoksinom diska i ispitivanja kulture pokazuje eetoksigennosti. Studija smatra toksični kulture, taloženje ove kulture esliliniya spaja kutom s kontrolnom linieypretsipitatsii soja. Nedostatak oborina linija uispytuemyh kulture nakon 48 sati, ako imaju kontrolnyhshtammov pokazuje nikakvu toxigenicity imaju izuchaemyhkultur. precipitinsku liniju u kontrolnim sojevima dolzhnypoyavlyatsya nakon 18 - 24 sati. Kasnije pojave liniypretsipitatsii zahtijeva hranjivi potvrdu za kontrolu kvalitete srednje ilizameny shtamma.Hranenie kontrolnog soja u kontrolnoj laboratoriiDlya skladištenje soja u laboratoriju mozhnoispolzovat polukruti agar pripravljen serum nabulone Martin i drugi bujonu (pH 7,6). Imajte vholodilnike presađivanje jednom svaka 2 - 3 mjeseca. Polutekući agarrazlivayut 8 ml epruvete i 1 ml goveđeg syvorotkikrupnogo skota.Kontrolny izvedbi toksigennyyshtammkorinebaktery difterije gravis dobivenog u Državnom Research Institute standardizacije ikontrolya medicinskih i bioloških preparatovim.L.A. Tarasevich. U suđenje na toxigenicity ne može koristiti vkachestve kontrolu, proizvodnja soj PW-8 i potrebno je povremeno varianty.Kontrolny soj pasira na krovyanomagare. Za uspješnu identifikaciju Corynebacteria difteriikontrolny Toksikogene soj presađuju svakih 1 - 2 sutok.METODIKI DEFINICIJE PRIZNAKOVOPREDELENIE TSISTINAZNOY biokemijske aktivnosti (PRIMJER Pisa) Corynebacterium difterije i Corynebacteria ultserans, unlikefrom lozhnodifteriynoy Hoffmann i drugih šipki korineformnyhbaktery posjeduje enzim tsistinazoy.Ispytuemuyu kulture inokulirani petlje "ubod" , U pitatelnuyusredu za određivanje tsistinazy, izlivena u uski probirkistolbikom visine 3 cm hranjivog sastava podloge ima cistin octenu - kiselina vodi. Tijekom produtsiruettsistinazu kulture rasta, cijepajući tsistin- i oblikovan na etomserovodorod reagira s octenom kiseline - olova, sumpora u kotoryyprevraschaetsya - olovo kiselina - spoj -Brown tamnu boju. Corynebczcterium difterije i korinebakteriyultserans nije jedini uzrok crnjenje medija tijekom injekcije, ali iobrazuyut tamni oblak oko njega - smeđa narasstoyanii oko 1 cm od srednje površine. Reaktsiiuchityvayut rezultati nakon 24 sata. U prisutnosti multiple dlyapolucheniya rasta ubrzati reakciju (tijekom 3 sata), u mediju za kulturu inokuliruyutbolshim iznos. Istovremeno ispytuemymikulturami, dodavanje klice se provodi na kontrolnoj soja otdelnuyuprobirku.OPREDELENIE ureaza AKTIVNOSTILozhnodifteriynye Hoffmann coli, Corynebacterium ultserans inekotorye drugih mikroorganizama roda Corynebacterium proizvesti obladayutsposobnostyu tijekom rasta irasscheplyat enzima ureaze uree. Corynebacterium difterije kao sposobnost neobladayut.Probu ureaza može se staviti u dvije varijante - po metoduZakse (a) i nanošenjem na podloge s ureom (b) .A) za postupak ureaze Sachse bez pripreme smeshivayut1 dio reagensa A i 19 dijelova reagensa B. smjesa je ulivena u 0.1 ml uzkieprobirki izradu jednu petlju i ispitati čiste kulturyso agara cijevi ili Pisa mediju. Za vydachiuskorennogo odgovora u prisutnosti multiple rasta na ploči odnotipnyhkolony početnog sađenja, kolonije ostavljena vnesenieneskolkih jednog uzorka cijevi ureaze. Rezultatuchityvayut nakon inkubacije u inkubatoru na 37sh C 30 min.b) čista kultura Corynebacterium difterije u smochevinoy inokulira bujonu, prelije se u epruvete za 2 - 3 ml, te stavljena u inkubator, rezultat u 24 sata inkubacije pri 37sh C.Ferment ureaza cijepa iuglekisloty uree kako bi se dobilo amonijaka. To povećava pH medija i nastaje izmenenietsveta indikator (crvenilo). U odsutnosti ovog enzima issleduemoykultury, medij ne bojenje proiskhodit.Rekomenduetsya simultano u odvojenoj epruveti zasevatkontrolny shtamm.OPREDELENIE saccharolytic AKTIVNOSTIDlya identifikaciju Corynebacterium difterije takzheotsenku koristiti saccharolytic aktivnost izoliranih kulturama sredahGissa ugljikohidrata - saharoza, glukoza, topljivog krahmalom.Kazhduyu cijevi s medijem šum inokulirana je s 1 petlje chistoykultury. Rezultat nakon 24 sata i pri otritsatelnomkrahmalnom znak - oblikovan kiseline je obnova i obezbojena fuksin sredapriobretaet grimiznu boju nakon 48 sati kulture usjevi vtermostate na 37sh C.Pri fermentacije karbohidrata. Preporučena stavitprobu istovremeno s kontrolnom soja Corynebacterium difterije variantagravis.OPREDELENIE nitrat reduktaze AKTIVNOSTISposobnost Corynebacterium difterije vratiti soliazotnoy kiselina (nitrata) u solima dušikovi kiselina (nitriti) je dodatna značajka koja omogućuje differentsirovatkorinebaktery kultura sjemena ultserans.Proizvodyat se proučava u epruveti s nitratnymbulonom, inkubira kroz 24 sata pri 37sh C.Zatem dodaje se 2 - 3 kapi reagensa za nitrita (Griess iliKasatkina ). Ako je i formiranje nitrita, sredaokrashivaetsya crveno. Ako nije obladaetnitratreduktazoy mikroorganizam, medij bez promjena boje proiskhodit.Odnovremenno sa epruvetama, inkubira kontrolnuyuprobirku sterilni sredoy.5. SredyKachestvo hranjiv kultura mediji bitno kada studija lyubombakteriologicheskom. Da bi se postigla maksimalnoyvysevaemosti Chlamydia difteriju ispitnog materijala, potrebno je stvoriti optimalne uvjete za rast, etihbaktery očuvanje reprodukcije njihovih bioloških svojstava, kao i dlyaingibirovaniya prateći rast mikroflore. To dostigaetsyaputem koristiti univerzalne baze hranjivih tvari s dobavleniemkrovi i kalij teluridna. Kalij teluridna u opredelennoykontsentratsii ne inhibirati rast predstavnici rodakorinebaktery i gotovo u potpunosti inhibira medij za rast su postoronneymikroflory.Krovyanyetelluritovye takzhedifferentsialno - dijagnostički kao koloniikorinebaktery na tim medijima imaju sive ili crne boje (ovi mikroorganizmi su u mogućnosti vratiti kalij teluridna dometallicheskogo telurij crnu tvar, i akumuliraju egovnutri stanice) .NPO "hranilistima", Makhachkala suhuyuhinozolnuyu stvara razliku - dijagnostičke srijeda Buchina dlyavydeleniya Chlamydia difterije, koji se dobiva od recepata naetiketke bio obogaćen s 5% krvi (br dobavleniesyvorotki umjesto krvi). Buchina srijeda lošiji krovyanymtelluritovym srijedom za inhibitorne aktivnosti i koloniivozbuditelya difterije može se pojaviti dan kasnije nego nakrovyanyh telluritovyh okruženja. U posljednjih nekoliko godina, institut prikladnoymikrobiologii (.. N Obolensk Moskva regija) proizvodi pitatelnuyusredu izolirati Chlamydia difterije - korinebakagar.Odnako, u usporedbi s telluritovymi krvi okruženjima dannoysrede rasti u 2 - 3 puta manjim kolonijama korinebakteriydifterii.Uchityvaya gore, ipak, pitatelnymisredami najbolje za primarnu inokulacije materijalu krovyanyetelluritovye medij. Kao osnova za te medije mozhnoispolzovat suha hranjivim agar (SPA) neprofitne organizacije"hranilistima" (Makhachkala) na hranjivom agaru osnovepankreaticheskogo hidrolizata, riblje brašno (RM) Proizvodnja GNIIPM (br. Obolensk). Hranjivi agar pripravljen je oznakom recept iextempore dodan krvi i teluridna kaliya.Dlya određivanje svojstava Toksikogene Corynebacteria difteriivypuskaetsya komercijalni kemijska srijeda OTDM (udruga "Pitatelnyesredy"..., Makhachkala) i GNIIPM (n Obolensk Moskva regija) Podaci o medijima koji je pripremio recept etiketke.Luchshey na temelju pripremu uzoraka okoliša i za opredeleniyatoksigennosti Pisi ostaje otvorena ložišta pepton, kotoryygotovitsya u laboratoriju ili u odjelima prehrambene srednekotoryh znanstveno - istraživačkog institucije za prigotovleniyaMartenovskogo agara.Dlya odustajanja kolonija i uzgoj Corynebacterium difterije vlaboratornyh uvjetima pripreme serumu agar sredu.Primenenie serum je preklopljen netseleso braznym.Kazhdaya nova serija hranjive podloge (oba komercijalni iprigotovlennoy in vitro) podlezhitbakteriologicheskomu kontrolu. U slučajevima u kojima je hranjivom mediju rostovyesvoystva ne zadovoljava predyavlyaemymtrebovaniyam, hranjiva juha agara baze dobije -suhoy hranjiva podloga (SPB) proizvedeni NPO "Pitatelnyesredy" (Makhachkala), vrijeme-bulonproizvodstvaGNIIPM (n Obolensk.) - bujon aminopeptide mikrobioloških tseleyproizvodstva klaonicama (grad Petrogradu, Armavir, Stavropola „) i podloge, pripravljen u laboratoriju (Hottinger digest, pepton 1% vode, sadržaj aminnogoazota 150 -, 180 mg /%) medij za kulturu početnog sađenja sloj chashkamPetri prelije u 3 - 4 mm. Oni se mogu koristiti u techenie3 dana kada se čuvaju pri temperaturi 4sh C.METODY PRIPREME I hranilistima REAKTIVOVTRANSPORTNAYA medij (medij akumulacija) kao osnova za dobivanje transporta sredyispolzuyut 0,1% hranjivom agaru na Hottinger sažeto ili 0.1% agar komercijalni hranjiva podloga, pH 7,6.0,1% agar baza je stavljena u epruvete za ispitivanje u 4 ml sterilizuyutv autoklavu pri 1 atm tijekom 20 minuta. vrijeme zadržavanja - do 1 mjesec na 4sh C prije upotrebe, u svaku epruvetu ssoblyudeniem aseptički tehnika, doda se 0,5 - 1,0 ml syvorotkikrupnogo goveda i 0.05 ml (1 kap) od 2% kalij rastvoratellurita. Selektivno kontrolirati okoliš sterilnosti održavanje na 37sh C tijekom 48 sati. Rok trajanja gotovoysredy - 10 dana na 4sh C.ZHIDKAYA hranjivom mediju za namjene GUBITKA RNGAS toksin difterije indikacija RNGA materijal chashkipervichnogo sijanje inokulirani u epruvetu s tekućem mediju syvorotochnoypitatelnoy pripravljen na bazi juha Martin ssoderzhaniem amina dušika od 150 - 180 mg /% pH 7,6. Pitatelnyybulon izlivena u epruvete u 3.5 ml, sterilizirana autoklaviranjem pri1 atm. 20 min. rok trajanja - do 1 mjesec. pri temperature4sh C.Pered potrošnje svaku cijev u odnosu pravilaseptiki doda 0,5 ml seruma goveda i0,05 ml (1 kap) 2% -tne otopine kalijevog teluridna. Kontroliruyutna sterilni medij i pohranjeni na isti način kao za primarnu polutekući transportnuyusredu.SREDY zasijavanja ispitivani MATERIALASreda Clauberg IIk 100 ml sterilne hranjivi agar baze (pH 7,6), tali i ohladi na 50sh C, glitserinovoysmesi 10 ml, 50 ml "lak" Krv i 3 mL otopine teluridna 2% kaliya.Prinimaya jasno da hranjivi medij, te je smjesa razvoditsyaglitserinovoy "lak" krv u 1,6 puta dao srednje priprigotovlenii treba povećati težio suhogopitatelnogo agar izračun 1.6 raza.Primer. Naljepnica na bočicu sa suhim kommercheskimpitatelnym agar sadrži važu potrebna za prigotovleniyaodnogo litru srednje D. Za Primjer 30 Priprema 1 litrapitatelnoy osnovu Clauberg II medij treba uzeti navesku48 g (odnosno, 30 g x 1,6 = 48 g) .Za hrana glicerin smjesa u 40 ml krvi ili defibrinirovannoykrovi smjesu se doda 20 ml glicerina (kemijski chistogosterilnogo glicerolom sterilizirane na 110sh Savanoriu Str temperaturi tijekom 30 min.). za pripravu "lak" Krv sterilnoydistillirovannoy 34 ml vode doda se 16 ml defibriniranom krovi.KROVYaNOY TELLURITOVY agaru (KTA) Za 100 ml sterilne hranjivi agar baze (pH 7,6), tali i ohladi na 50sh ° C, doda se 7 ml 10 mldefibrinirovannoy ili hemolizirani krv i 2 ml 2% otopinom kalij teluridna. Umjesto toga, krv se može koristiti suhuyutelluritovuyu smjesa (11 ml u 100 ml medija), dok je na 100 mlKTA bez pripreme 1 ml 2% -tne otopine kalijevog teluridna, t.k.1 ml 2% -tne otopine već sadržani u 11 ml krvi telluritovoysmesi. Uzimajući u obzir da je za ishranu medij razvoditsyakrovyu oko 1,1 puta, u pripravi srednjem sleduetuvelichit izvaže suhi hranjivi agar izračun 1.1 raza.Primer. Naljepnica na bočicu sa suhim kommercheskimpitatelnym agar sadrži važu potrebna za prigotovleniyaodnogo litru medija, na primjer, 30 F. Za pripravu 1 litrapitatelnoy osnovu HAT mora uzeti uzorak od 33 g (30 g tj x1,1 = 33 g) .METODIKA PRIPREMA KROVYANYHI KROVYANO - TELLURITOVYH SMESEYDlya priprema hranilistima najboljih ispolzovatdefibrikirovannuyu krv životinja - goveda, konji, svinje, ovce. Krv se skuplja u sterilnyesosudy s perle koristeći posebno montiran sustav u aseptičkim uvjetima. U nekim slučajevima, krv je sakupljena, nemontiruya posebnih sustava, spajanjem prvog obroka krvi korištenje vnebutyli.Mozhno ljudske krvi istekao (citrat i konzervansi) priprema iz toga spetsialnyekrovyanye smjese. Za to je potrebno da se ukloni krv tekući chastotstoyavsheysya sadrži natrij citrat i konzervanse. Kostan eritrocita mase u posudi doda sterilnyyfiziologichesky rješenje koje može ukloniti posleosedaniya eritrocita, i dodana destilirana voda dopervonachalnogo obema.Horoshim syremdlyapolucheniya Smjesa krv sluzhiteritrotsitarnaya mase koji mogu ostati pri proizvodstvegammaglobulina i drugi proizvodi od krvi. U eritrocitima massedobavlyayut sterilne destilirane vode brzinom od 1/3 obemaeritrotsitarnoy massy.Mozhno koristiti krvnih ugrušaka preostale posleserologicheskih reakcije (s negativnim rezultatom reakcije), ili ugrušaka abortnoy placente krvi. Vsterilnye ugrušci skupljati boce sa staklenim perlama i razbijenog stakla, a zatim zamrznuti i odmrznuti, a zatim ugrušaka lako razbivayutsyabusami. Ovaj postupak se može ponoviti 2 - 3 puta. Zatim dobavlyayutsterilnuyu destiliranu vodu u iznosu od 1/4 smjese volumen krvi sgustkov.V dobiveni gornjim postupkom, kalij teluridna se dodaje kao konzervans. Za svakih 10 mlkrovyanoy smjesu se doda 1 ml 2% -tne otopine kalijevog teluridna. Takuyukrovyano - telluritovuyu smjesa se može pohraniti na 4sh C izračun w2 mesyatsev.Primer. Ako se supernatant citra-krv obemom250 ml 50 uklonjen - 60 ml tekućeg dijela, zatim neobhodimodobavit isti broj - 50 - otopina 60 ml sterilnogofiziologicheskogo, promiješati ponovo pustiti stajati, pri čemu uklanjanje 50 - 60 ml tekućeg dijela i da se 50 - 60 mlsterilnoy destilirane vode. Dakle, to će polucheno250 ml smjese krvi. Potrebno je da očuvanje dobavit25 ml 2% kalij teluridna (za svaki 10 ml krvi smesipribavlyayut 1 ml 2% kalijev teluridna) .U daljnjih u pripremi telluritovoy krvi sredyna svakih 100 ml hranjive agar se doda 11 mL krovyanoytelluritovoy smjesu (10 ml smjese krvi i 1 ml rastvoratellurita 2% kalij). Priprem u takvom mediju se dalje doda 1 ml 2% otopine kaliya.Prigotovlenie teluridna otopinu teluridna kaliyaDlya telluritovyh medij koristi spreman kommercheskiy2% otopina teluridna kaliya.Pri odsutnost komercijalno dostupnog teluridna otopinu kaliyagotovyat slijedi: 100 ml destilirane vodyrastvoryayut 2 g kristalnog kalij teluridna. Za sterilizatsiirastvor zagrijava u kipućoj vodenoj kupelji tijekom 30 min. i zadržati pritemperature 4shC. Kristalna kalijeva teluridna hranyatgermeticheski zatvoren bankovni tamno stekla.SYVOROTOChNY AGARSyvorotochny agar koji se koristi za probir kolonije ikultivirovaniya Corynebacterium difterije, mogu se proizvesti dovoljno ljubavi gornjeg hranjiva osnov.K 100 ml rastali i ohladi na temperaturu 50sh Cpitatelnogo agar (pH 7,6) 10 ml sterilne syvorotkikrupnogo stoku. Medij se miješa, izlije vsterilnye cijevi na 4 - 5 ml, te ih u naklonnompolozhenii za koso svake šarže kotorogoproveryaetsya sterilnost. Nekoliko cijevi se stavljaju na noćnom termostata. U slučaju klijanja medij odbačen sve žljebasti partiya.Probirki serumu agar pohranjen na 4sh C w2 nedel.MARTENOVSKY agar VODOYDVOYNOY KONTsENTRATsIIMartenovsky mesa pepton - 0,5 l, meso voda - 0,5 l, agar -agar - 15 g octene - kiselina natrijeva - 5 g, maltoza - 3 g.15 g agar ispere tijekom radnog dana protochnoyvodoprovodnoy u vodi, isušen i pažljivo prenese u 1 lmartenovskogo bujonu (0,5 l ložišta peptona i 0.5 l myasnoyvody). Podesi na pH 7,8 - 8,0 pomoću alkalizacijskog bulona20% otopine NaOH u radu s krezol crvenom pokazatelj, koji je u ovoj reakciji mijenja boju u ružičastu žuta -malinovy. Bujon je refluksirana 10 min. zatim 0.5% (5 g na 1 L) octena - kiselina, natrijeva, 0,3% od maltoze (3 g na 1 L), pH se provjerava i, ako je potrebno, ponovno podešen na 7,8 - 8,0, grije . vtechenie 15 minuta, pusti se stajati na toplom (na termostatu Koch vozila) 2 - 3 sata i filtrira se kroz pamučni tkaninom ili -marlevy filter. Puni u sterilne bočice (70 - 80 ml) pribolshom opterećenja ili cijevi (10 ml) i sterilizuyutodnokratno teče pare 30 min.Martenovsky peptonSvinye želuca, ponajprije u paru s elastičnim zidove velikih količina sluzi i kataralni simptomima bez pročišćen otzhira (želuci impregnirani žuč odbaci), smanjiti iizmelchayut brusilicu. Dobiveni usitnjeni želuca stavi vbutyli kapacitet od 3 - 5 litara, i zagrijava na izlije 50sh C vodoyiz na 1 litru vodu 300 - 500 g mljevene mase. Postoji zhedobavlyayut 1% kemijski čist klorovodične kiseline (gustoća 1,19). Maseni dobro promiješa i stavi u termostatu, pri 15 -18 sati (ili više) u 37sh C- ili, ako je to otdelnogotermostata 42sh C, 18 sati (ili više). Tijekom protsessaperevarivaniyabutyl poljuljati u početku češće (nakon 1 do 1,5 sati), a zatim rjeđe. Dobro probavljaju pepton butylilezhit donji sloj od finih tamno taloženja osadka.Polnotu balastne proteina male provjeriti putemdobavleniya u 5 ml filtrira peptona 1 - 2 kapi 10% NaOH, zamućenje ne treba poyavlyatsya.Deystvie enzim zaustavljena zagrijavanjem u vodenoj kupelji, postupno dovođenje temperature za 80sh C popokazaniyu uspostavljena termometrom uronjen u boci perevarom.Nagrevanie nastavlja tijekom 10 min. U tu svrhu, uređaj mozhnoispolzovat Koch ili autoklavu. Tschatelnovzbaltyvayut boce zatvorene pamučne gaze s - bumazhnymkolpachkom čepom stavi na suhom i hladnom mjestu za otstaivaniyapri temperaturi ispod 12sh C Pepton korisna neranee od 7 dana, kada je čvrsto podmiriti suspendira chastitsy.Neobhodimo doda 20 ml kloroforma na 1 l peptona dlyakonservirovaniya i zatvaranje boca s gumenim čepom. To mogu biti pohranjeni videpepton bez sterilizacije na sobnoj temperature.Myasnaya vodaDlya kuhanje mesa u vodi dvostruke koncentracije zhelatelnoispolzovat svježe meso mladih životinja upitannosti.Obezzhirennoe medij oslobođen od mesa tetive prošao cherezmyasorubku, uliti vode u 1 litri vode po 1 kg mljevenog iostavlyayut noći na 4sh C, smjesa se grije na jutarnje asbestovoysetke za 15 - 20 minuta. od trenutka ključanja. Spreman otvarfiltruyut, mljevena isušen, dobivena meso se prelije vsterilnye bocu s vodom 250 - 500 ml, te sterilizira parom3 tekućine uzastopnih dana do 30 min. Pohranjeni na 4sh C.Bumazhki indikator krezola krasnyy0,1 g crvenog krezol se otopi u 100 ml 95% alkohola, na temperaturi iostavlyayut 37sh ° C tijekom 24 sata, često uz tresenje. Dan iseljenika navlaženu u otopini filtrovalnoybumagi trake i brzo suši. Svijetlo žuta boja - radovi u schelochnoysrede odvija se u različitim nijansama krasnogo.SREDY ZA ODREĐIVANJE TSISTINAZNOY AKTIVNOSTISreda Pisa na OHF agareK 90 ml tekućeg 1,5% agara OHF (nije dopuštena upotreba Hottinger agar), pH 7,6, dobavlyayut2 ml 1% otopine L -tsistina 0,1 N otopina klorovodične kiseline (HCl), temeljito promiješa i isti volumen 0,1 N rastvoraNaOH da se neutralizira kiselina. Kiselina i alkalne otopine dolzhnybyt međusobno titrirani, ispolzovatfiksanaly mogu se proizvesti kemijskim promyshlennosti.Sredu sterilizirane pri 112sh ° C tijekom 30 minuta, koji su pohranjeni 1 mjeseca pri 4sh C.Agar s cisteinom tali pri 90SH C (medij ne kuhati. - Dlyasohraneniya cistin). Ohlađenom mediju dodano 45sh C1 ml10 otopine% olova acetata i 9 ml seruma goveda krupnogorogatogo aseptičkim uvjetima i pakiraju poprobirkam.Neobhodimo napomenu da kada je temperatura 50sh C i više, u prisustvu olovo acetata, a serum mutna sredapriobretaet mliječna boja. Teško je račun rezultatovreaktsii.Sreda Pisa-based tržišno okruženje AGVDlya Pisa medij za kuhanje mogu biti dostupne na sastavu trgovačkog isbalansirovannuyu AGV srednje koristi vbakteriologicheskoy praksi kako bi se utvrdilo chuvstvitelnostimikroorganizmov na antibiotike. Izvagane dio suhom AGV vkolichestve 2,7 g stavi se u 90 ml destilirane vode i grije doee potpunog otapanja. Pripremiti 5% otopina hidrogenkarbonata natriya.Dlya otopi se 0,5 g hidrogenkarbonata u 10 ml destilirane otopine vody.Zatem doda se 0,1 g L-cisteina i zagrije do polnogorastvoreniya cistina. Zatim 2 ml kipuće alkalnog rastvoratsistina uvodi u 90 ml rastopljenog srednje AGV, pH podesi i sterilizira na do7,6 112sh C tijekom 10 minuta. Rastaljenoj iohlazhdennoy 45sh u C kroz uzastopno se doda: 10 mlsyvorotki goveda, 1 ml 10% rastvorauksusnokislogo vodi, svježe pripremljene 1,5 ml sterilne 10% -tne otopine natrijevog tiosulfata i izlivena u probirkam.Rastvory olovo acetata i natrijevog tiosulfata gotovyatextempore pomoću sterilne cijevi i destilirana voda teče sterilizira pare ili u vodenoj kupelji 30 min.Danny variantsredy Pise otsutstviiMartenovskogo koristi u agaru. Odnakoneobhodimouchityvat, chtodifferentsialno - dijagnostička svojstva ovog okoliša comparisonwith mediju pripremljeni na agaru OHF manje vyrazheny.SREDY ODREĐIVANJA ureaza AKTIVNOSTIProbu ureaza može se staviti u dvije izvedbe: metode Sachse Iput inokulacije juhe sa mochevinoy.Prigotovlenie opredeleniyaureaznoy reagensa za aktivnost je metoda ZakseGotovyat reagens 2 - a i V.Reaktiv a: Urea 2% etil alkohol g96 2 mlDistillirovannaya 4 mlReaktiv voda B: 0.2% otopina fenolrot 1 mlOdnozameschenny kalijev fosfat (KH PO) 0,1 r2 4Dv supstituirani kalijev fosfat (K HPO) 0,1 gHlorid natrij (NaCl) 2 40,5 gDistillirovannaya voda100 mlReaktiv A nije sterilizira i spremi na 4sh C.Reaktiv autoklavu Fluidni parom.Bulon mochevinoyK sa 100 ml sterilne mesa - ili pepton Hottinger otopina (pH 7,0) doda se 1 g uree, i 0,2 ml 1,6% alkohola rastvoraindikatora krezolrot. Prelije u 2 - 3 ml u sterilne epruvete propuštanjem pare sterilizirane 10 min.SREDA ODREĐIVANJA saccharolytic AKTIVNOSTIDlya određuju saccharolytic aktivnost rekomenduetsyaispolzovat medij 1% peptona vode.K doda se 100 ml vruće destilirane vode 1 g pepton 0,5 g, kemijski čisti NaCl i 1 ml indikator Andrede.Ustanavlivayut pH 7,4, kuha se 5 min., filtrirana kroz filter papir ilipolotnyany, podesi na izvorni volumen goryacheydistillirovannoy vode. To se doda jedna osnova izuglevodov saharozu, glukozu (1 g), škrob (0,5 g) .Among prelije se u epruvete za 2 - 3 ml, te sterilizira tekuchimparom tijekom 3 dana na 30 min. ili 0,5 atm. 30 min. Gotovyesredy indikator Andred su bezbojni ili blago rozovatyyottenok.Indikator AndredePosuda za dobivanje indikatora treba biti suha, kemijski čista, s tla probkoy.K 100 ml destilirane vode, doda se 0,5 g kiseline fuksinai 16,4 ml 4-postotnom otopinom NaOH. Rješenje za dan ostavlyayutpri 37sh C, povremeno trese, dva dana zadržao nasvete a zatim uklonjeni u tamnom mjestu. Svježe pripravljena rastvorimeet slame - žute ili blago ružičaste boje, kotoryyischezaet tijekom skladištenja. Kada intenzivno - ružičasta okraskerastvora za kuhanje indikator mora dobavitesche 1,6 ml 4-postotnom otopinom NaOH.SREDA ODREĐIVANJA nitrat reduktaze AKTIVNOSTIK 100 ml bujonu (BCH ili Hottinger juha) pH 7,3 - 7,5, bez nitrila (provjera Grissaili Kasatkina reagens) dodano je 0,1 g slobodne nitratakaliya nitrita (kno). Ponovno provjeriti za nitrita po32 ml i razdijeljeni u kemijski čistu, suhu epruvetu. Ovaj medij se sterilizira 15 min.pri 120sh C.Reaktiv GrissaRastvor 1: 0,8% sulfanilna kiselina u octenoj 5N kislote.Rastvor 2: 0.6% alfa-dimetil-5N uksusnoykislote.Pered naftalamin izvođenju reakcijske smjese jednake volumene otopina 1 i 2. reagens pogodni za korištenje tijekom 15 minuta, bezbojni, pripoyavlenii ružičastog obojenja. - neupotrebljiv. Otopine 1 i 2 hranyatpri 4sh C za 2 mes.Reaktiv KasatkinaRastvor 1: 0,1% -tna otopina u destiliranoj rivanola vode.Rastvor 2: 12% otopina klorovodične kiseline (HCl), obavljaju .Prior reakcijske smjese jednake volumene otopine 1 i 2. reagens goden za uporabu u 15 min. Otopine 1 i pri 2hranyat 4sh C tijekom 2 mes.RETsEPTY KRASOK1. Alkalni metilen plavo Lefflera.Distillirovannaya ML1 99% vodena otopina kalij hidroksida (KOH) 1% alkohola ml10 metilen plavo 30 mlSmeshat. Bojanje 1 - 2 Min.2. Octena siniy.Toluidinovy ​​toluidin plavo gLedyanaya octena kislota2 0,5 ml96% etil alkohol 5 100 mlSmeshat mlDistillirovannaya vode. Bojanje 3 - 5 Min.3. Kristal violet fioletovyy.Kristallichesky R5 0.25% otopina octene kiseline 100 mlSmeshat. Filtrira. Boja za 5 - 7 min.METODY hranjive SREDBakteriologicheskomu kontrolnog subjekta pervichnogoposevamateriala medij i medij za određivanje Toksikogene, saccharolytic i biokemijska svojstva. Kod proizvodnje sredvazhnym moment preliminarni kontrola medij nasoderzhanie amin baze azota.METOD kvantitativno određivanje AMINO AZOTAPrintsip metoda se temelji na blokiranju formaldehida u pH7,0 slobodne amine i alkalijski titracije ekvivalentnogokolichestva karboksilnih skupina. Početak i kraj titrovaniyaopredelyayut potentsiometricheski.Reaktivy: 1. Natrijev hidroksid (NaOH), 0,1N rastvor.2. Klorovodične kiseline (HCl), 0,1N rastvor.4. Formalin (40% otopina formaldehida). Prije kazhdymopredeleniem potrebno kako bi se pH na formalin 7,0.Hod opredeleniyaDlya analizira određenu količinu tekućeg uzorka. Dlyazhidkih hidrolizata s niskim stupnjem razgradnje (0,1 - 0,2% amina dušika) - 3 ML s prosječnim stupnjem cijepanje (0,3 -0,6% amin oksid) - 1 ML s visokim stupnjem cijepanje (0,7 -1.3% amin oksid) - 0,5 kulturu medija ML tekućina (0.08 -0.04% dušik amina) - 3 ML tekući ekstrakt (0.02 -0.04% amin oksid) - 10 ml.V čaša 50 ml ispitnog uzorka i čine volumen dovodyatobschy destilirane vode do 20 ml. Elektrodypotentsiometra uronjen u test otopinu i pHrastvora podesi na 7,0 sa NaOH 0,1N 0,1N rastvoraHCl ili otopine. Zatim 2 ml neutralnog formalinom i miješa bez skidanja elektrode, sadržaj uzorka titriranja 0,1Nrastvora NaOH na pH 9,1. U titracije treba ispolzovatmikrobyuretku 5 ml.Soderzhanie amino dušik u uzorku u% (X) se izračunava formulom: A x K x 1.4 x = 100X ----------------- , gdeB x 1000A - broj 0,1N otopinom NaOH u ml koja je išla u titrovanieissleduemoy uzorka K - korekciju za titar 0,1N NaOH otopina 1,4 - količina amina dušika u mg što je ekvivalent za 1 ml NaOH 100 0,1Nrastvora - faktor konverzije u kamata-B - količina tekućeg uzorka u mililitrima uzetih za analizu-1000 - koeficijent konverzija mg g.METOD bakteriološka hranjive SREDV praktične za laboratorije zhdaya mediji serija kultura, posebno kada se koristi nova baza (ililaboratornogo industrijske proizvodnje) i novih sastojaka podlezhitbakteriologicheskomu kontrolu zbog mogućeg nestandartnosti.1. Kontrola kvalitete medija za sijanje primarnog issleduemogomateriala postavljen određivanjem: a) klijanje stanica Corynebacterium difterije-b) vrijeme do formiranja kolonija) ingibiruyuscheyaktivnostiv poštivanje soputstvuyuscheymikroflory.S koriste za ovu svrhu kontrole Toksikogene soja ilisvezhevydelennye Toksikogene kulture corynebacterium diphtheriae stipichnymi kulturno - morfološka svojstva shtammzolotistogo aureus (музейный или свежевыделенный).Суточные культуры коринебактерий дифтерии и стафилококка,вы ращенные на сывороточном агаре, смывают физиологическимраствором. Мутность полученной суспензии должна соответствовать10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. LA Тарасевича(условно 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл взвеси). Из исходныхвзвесей культур коринебактерий дифтерии и стафилококка готовятпоследовательные разведения вфизиологическомрастворе(см. схему).СХЕМАПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КУЛЬТУРЫ КОРИНЕБАКТЕРИЙДИФТЕРИИ И СТАФИЛОКОККА+-----+-----------+---------------------------+------------------+| N | Кол-во | Объем вносимой | Условное кол-во ||про- | физиол. | суспензии, мл | микр. клеток ||бирки| р-ра, мл | | в 1 мл взвеси |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 8 || 1 |1,0| 1,0 из исходной взвеси| 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 7 || 2 |4,5| 0,5 из 1-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 6 || 3 |4,5| 0,5 из 2-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 5 || 4 |4,5| 0,5 из 3-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 4 || 5 |4,5| 0,5 из 4-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 3 || 6 |4,5| 0.5 
Dijelite na društvenim mrežama: 

 
Povezan
 
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.
Medicinska zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, zakoni.